CHO細胞外泌體的分離和表征技術
CHO 細胞是一種廣泛用于生物制藥蛋白質生產的宿主。 CHO 細胞中分離外泌體主要采用聚合物的沉淀 (PBP) 技術從分批培養(yǎng)中分離和富集細胞外泌體囊泡。分離后的外泌體可以通過多種方法來檢測和表征分離的囊泡，這些分析包括動態(tài)光散射 (DLS) 和 Zeta 電位測量、電子顯微鏡 (EM) 和外泌體標記物分析、RNA 和脂質分析等。
一、細胞培養(yǎng)
1.培養(yǎng)基與細胞
細胞可使用CHO系中的CHO-S 細胞。
培養(yǎng)基使用 CD-CHO 培養(yǎng)基（ThermoFisher）。在培養(yǎng)基中添加 8 mM L-谷氨酰胺利于CHO細胞生長。
2. 培養(yǎng)：
培養(yǎng)物通常在錐形瓶中以 20 ml 分批培養(yǎng)模式在二氧化碳振蕩培養(yǎng)箱中 37 °C 下以 120 rpm 搖動培養(yǎng)。細胞每 3-5 天傳代一次，接種率為 0.2 × 10 6 個活細胞/ml。對于制備外來體制劑的分批培養(yǎng)，將細胞以 0.2 × 10 6 個活細胞/ml 接種在 20 ml 培養(yǎng)物中，然后在培養(yǎng)的第 3 天和第 5 天收獲上清液。
3. 收獲：
收獲后的樣本，細胞沉淀物和 5 個 3 × 10 6細胞沉淀物樣品進行等分，用于細胞脂質和蛋白質分析。通過高速離心機以 2,000×g 離心 5 分鐘沉淀細胞，并儲存在 - 80 °C超低溫冰箱中。所有剩余的培養(yǎng)物上清液都用于分離外泌體，如下所述。
二、通過聚合物沉淀法 (PBP) 制備外泌體
根據制造商的指南，使用 TEI 總外泌體分離試劑盒（Invitrogen）從培養(yǎng)基中分離外泌體。將細胞培養(yǎng)基以 2000× g離心30 分鐘以去除細胞和任何碎片；隨后將上清液小心移至離心管管中，加入 0.5 倍體積的 TEI 試劑，充分混合并在 4°C 下孵育過夜。然后將樣品在 4°C 下以 10,000× g離心1 小時，然后在棄去上清液后，將富含外泌體的顆粒重新懸浮在 75 μl PBS 緩沖液中。然后將樣品儲存在 - 20°C 下，直到需要進行后續(xù)分析。
外泌體的表征分析
1.動態(tài)光散射
使用 Anton-Paar Lightsizer 500 粒子分析儀測定外泌體制劑中的粒度分布。動態(tài)光散射測量由于溶液中粒子的布朗運動引起的散射光強度的動態(tài)波動，（685 nm 的激光，檢測角度為 15、90、175 度）；較小的粒子比較大的粒子移動得更快。
確定顆粒大小時，通常使用三種分布類型：
(1) 數量分布，報告不同大小“箱”中的顆粒數量；
(2) 體積分布報告不同尺寸類別的顆粒總體積；
(3) 強度分布，報告不同大小顆粒散射的光。
也可以使用高分辨率納米粒徑分析儀 Nanocoulter Ⅰ來分析樣品中每種大小的囊泡的實際數量、濃度及粒子動態(tài)、Zeta 電位等。
為了進行分析，將先前儲存在 - 20°C 的 75 μl 等分試樣的外泌體制劑用 925 μl PBS 稀釋（得到 1 ml）并轉移到一次性比色皿中用于 DLS 測量。每個樣品在 DLS 和 Zeta 電位實驗中測量五次，如下所述。
2. Zeta 電位
通過電泳光散射 (ELS) 測量的 Zeta 電位測量粒子在電泳場中的速度。Zeta 電位是膠體分散體穩(wěn)定性的指標（絕對值）和囊泡表面電荷的量度（+ 或 - 符號）。
3.電子顯微鏡分析
對于電子顯微鏡分析，外泌體制劑在 PBS 緩沖液中按 1:10 稀釋，隨后在等體積的 4% (w/v) 多聚甲醛和 1% (v/v) 戊二醛中固定 5 分鐘。然后將樣品置于 formvar-carbon 涂層的 600 目銅網格上，并在室溫下干燥 5 分鐘。隨后將樣品在乙酸雙氧鈾溶液（2% 水溶液）中進行對比，并在電子顯微鏡（Jeol1230 TEM）下觀察，加速電壓為 80 kV，并連接到數碼相機進行觀察 .
三、Bradford 分析法測定樣品中的蛋白質含量
為了量化培養(yǎng)第 3 天和第 5 天的 CHO 細胞沉淀物和外來體制劑中的蛋白質含量，對細胞裂解物以及外來體裂解物和 75 μl 等分試樣（每份均來自 1 ml 培養(yǎng)物）進行 Bradford 測定非裂解外泌體 。通過向細胞或外泌體制劑中添加先前描述的裂解緩沖液來制備裂解物。
1.SDS-PAGE 和蛋白質印跡
對裂解和未裂解的外泌體制劑以及分批培養(yǎng)第 3 天和第 5 天的細胞裂解物進行蛋白質印跡。所有樣品均在還原（含有 β-巰基乙醇）或非還原 Laemmli 樣品緩沖液中制備，在 95 °C 下煮沸 5 分鐘，隨后如前所述通過 12% SDS-PAGE 分離。每個蛋白質樣品上樣約 5 g。以下一抗用于已知外泌體標記物的蛋白質印跡；抗 CD63（Santa Cruz，sc-5275）、抗 CD81（Santa Cruz，sc-166029 和 sc-23962）和抗 TSG101（Santa Cruz，sc-136111）。
2. RNA分離和分析
從收獲的第 3 天和第 5 天的 3 個外泌體樣本中提取總 RNA。根據制造商的說明，使用總外泌體 RNA (TER) 和蛋白質分離試劑盒（Invitrogen）提取 RNA。從源自 1 ml 培養(yǎng)物的每個外泌體樣品中洗脫出 30-35 μl RNA。然后使用 NanoDrop ND-1000 分光光度計估計回收的 RNA 總量。
3.脂質分析
從 (a) 總細胞沉淀中提取脂質（1 × 10 6個活細胞，在第 3 天收獲時含有 298.9 g 蛋白質，在第 5 天收獲時含有 477.2 g 蛋白質），儲存在 - 80 °C，和（ b) 從 7 × 1 ml 培養(yǎng)物中分離出的合并外泌體（即我們在每個時間點從 1 ml 培養(yǎng)物中分離出 7 × 75 μl 等分試樣，然后將它們合并在一起）. 然后通過向細胞/外泌體制劑中加入氯仿：甲醇 (2:1) 溶液 (3 ml)，從這些樣品中提取脂質進行分析。
蘇州阿爾法生物提供的生物反應器、PCR儀、振蕩培養(yǎng)箱、離心機、細胞計數儀、細胞分析儀、電泳儀、粒徑分析儀、流式細胞儀等廣泛用于細胞外囊泡的分離和表征研究等。
一、細胞培養(yǎng)
1.培養(yǎng)基與細胞
細胞可使用CHO系中的CHO-S 細胞。
培養(yǎng)基使用 CD-CHO 培養(yǎng)基（ThermoFisher）。在培養(yǎng)基中添加 8 mM L-谷氨酰胺利于CHO細胞生長。
2. 培養(yǎng)：
培養(yǎng)物通常在錐形瓶中以 20 ml 分批培養(yǎng)模式在二氧化碳振蕩培養(yǎng)箱中 37 °C 下以 120 rpm 搖動培養(yǎng)。細胞每 3-5 天傳代一次，接種率為 0.2 × 10 6 個活細胞/ml。對于制備外來體制劑的分批培養(yǎng)，將細胞以 0.2 × 10 6 個活細胞/ml 接種在 20 ml 培養(yǎng)物中，然后在培養(yǎng)的第 3 天和第 5 天收獲上清液。
3. 收獲：
收獲后的樣本，細胞沉淀物和 5 個 3 × 10 6細胞沉淀物樣品進行等分，用于細胞脂質和蛋白質分析。通過高速離心機以 2,000×g 離心 5 分鐘沉淀細胞，并儲存在 - 80 °C超低溫冰箱中。所有剩余的培養(yǎng)物上清液都用于分離外泌體，如下所述。
二、通過聚合物沉淀法 (PBP) 制備外泌體
根據制造商的指南，使用 TEI 總外泌體分離試劑盒（Invitrogen）從培養(yǎng)基中分離外泌體。將細胞培養(yǎng)基以 2000× g離心30 分鐘以去除細胞和任何碎片；隨后將上清液小心移至離心管管中，加入 0.5 倍體積的 TEI 試劑，充分混合并在 4°C 下孵育過夜。然后將樣品在 4°C 下以 10,000× g離心1 小時，然后在棄去上清液后，將富含外泌體的顆粒重新懸浮在 75 μl PBS 緩沖液中。然后將樣品儲存在 - 20°C 下，直到需要進行后續(xù)分析。
外泌體的表征分析
1.動態(tài)光散射
使用 Anton-Paar Lightsizer 500 粒子分析儀測定外泌體制劑中的粒度分布。動態(tài)光散射測量由于溶液中粒子的布朗運動引起的散射光強度的動態(tài)波動，（685 nm 的激光，檢測角度為 15、90、175 度）；較小的粒子比較大的粒子移動得更快。
確定顆粒大小時，通常使用三種分布類型：
(1) 數量分布，報告不同大小“箱”中的顆粒數量；
(2) 體積分布報告不同尺寸類別的顆粒總體積；
(3) 強度分布，報告不同大小顆粒散射的光。
也可以使用高分辨率納米粒徑分析儀 Nanocoulter Ⅰ來分析樣品中每種大小的囊泡的實際數量、濃度及粒子動態(tài)、Zeta 電位等。
為了進行分析，將先前儲存在 - 20°C 的 75 μl 等分試樣的外泌體制劑用 925 μl PBS 稀釋（得到 1 ml）并轉移到一次性比色皿中用于 DLS 測量。每個樣品在 DLS 和 Zeta 電位實驗中測量五次，如下所述。
2. Zeta 電位
通過電泳光散射 (ELS) 測量的 Zeta 電位測量粒子在電泳場中的速度。Zeta 電位是膠體分散體穩(wěn)定性的指標（絕對值）和囊泡表面電荷的量度（+ 或 - 符號）。
3.電子顯微鏡分析
對于電子顯微鏡分析，外泌體制劑在 PBS 緩沖液中按 1:10 稀釋，隨后在等體積的 4% (w/v) 多聚甲醛和 1% (v/v) 戊二醛中固定 5 分鐘。然后將樣品置于 formvar-carbon 涂層的 600 目銅網格上，并在室溫下干燥 5 分鐘。隨后將樣品在乙酸雙氧鈾溶液（2% 水溶液）中進行對比，并在電子顯微鏡（Jeol1230 TEM）下觀察，加速電壓為 80 kV，并連接到數碼相機進行觀察 .
三、Bradford 分析法測定樣品中的蛋白質含量
為了量化培養(yǎng)第 3 天和第 5 天的 CHO 細胞沉淀物和外來體制劑中的蛋白質含量，對細胞裂解物以及外來體裂解物和 75 μl 等分試樣（每份均來自 1 ml 培養(yǎng)物）進行 Bradford 測定非裂解外泌體 。通過向細胞或外泌體制劑中添加先前描述的裂解緩沖液來制備裂解物。
1.SDS-PAGE 和蛋白質印跡
對裂解和未裂解的外泌體制劑以及分批培養(yǎng)第 3 天和第 5 天的細胞裂解物進行蛋白質印跡。所有樣品均在還原（含有 β-巰基乙醇）或非還原 Laemmli 樣品緩沖液中制備，在 95 °C 下煮沸 5 分鐘，隨后如前所述通過 12% SDS-PAGE 分離。每個蛋白質樣品上樣約 5 g。以下一抗用于已知外泌體標記物的蛋白質印跡；抗 CD63（Santa Cruz，sc-5275）、抗 CD81（Santa Cruz，sc-166029 和 sc-23962）和抗 TSG101（Santa Cruz，sc-136111）。
2. RNA分離和分析
從收獲的第 3 天和第 5 天的 3 個外泌體樣本中提取總 RNA。根據制造商的說明，使用總外泌體 RNA (TER) 和蛋白質分離試劑盒（Invitrogen）提取 RNA。從源自 1 ml 培養(yǎng)物的每個外泌體樣品中洗脫出 30-35 μl RNA。然后使用 NanoDrop ND-1000 分光光度計估計回收的 RNA 總量。
3.脂質分析
從 (a) 總細胞沉淀中提取脂質（1 × 10 6個活細胞，在第 3 天收獲時含有 298.9 g 蛋白質，在第 5 天收獲時含有 477.2 g 蛋白質），儲存在 - 80 °C，和（ b) 從 7 × 1 ml 培養(yǎng)物中分離出的合并外泌體（即我們在每個時間點從 1 ml 培養(yǎng)物中分離出 7 × 75 μl 等分試樣，然后將它們合并在一起）. 然后通過向細胞/外泌體制劑中加入氯仿：甲醇 (2:1) 溶液 (3 ml)，從這些樣品中提取脂質進行分析。
蘇州阿爾法生物提供的生物反應器、PCR儀、振蕩培養(yǎng)箱、離心機、細胞計數儀、細胞分析儀、電泳儀、粒徑分析儀、流式細胞儀等廣泛用于細胞外囊泡的分離和表征研究等。
