導(dǎo)讀

漢堡-埃彭多夫大學(xué)醫(yī)學(xué)中心（UKE）的研究者在Molecular Therapy: Methods & Clinical Development上發(fā)表了題為LATE–a novel sensitive cell-based assay　for the study of CRISPR/Cas9-related　long-term adverse treatment effects的文章。

文中應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)和naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)開發(fā)了一種長期不良治療效應(yīng)（LATE）體外檢測方法評估促生長脫靶事件的風(fēng)險，通過細(xì)胞轉(zhuǎn)化事件來評估Cas9蛋白的潛在毒性。在小規(guī)模原理驗證實驗中，可重復(fù)地檢測到由TP53基因脫靶切割引起的原代人新生兒包皮成纖維細(xì)胞（NUFF細(xì)胞）中低頻的（<0.5%）促生長事件。作者還比較了不同Cas9蛋白的脫靶毒性，證明現(xiàn)有的高保真核酸酶比第一代Cas9脫靶概率大幅降低。在這項概念驗證研究中，LATE檢測可以評估CRISPR/Cas9系統(tǒng)的生理學(xué)不良反應(yīng)，有利于臨床前安全性研究。

自CRISPR / Cas9技術(shù)問世以來，基因編輯已廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和應(yīng)用生物學(xué)領(lǐng)域，將其轉(zhuǎn)化為臨床試驗則引起了安全性問題。盡管脫靶事件的頻率和位置已被廣泛研究，但人們對它們在大規(guī)模、長期的應(yīng)用環(huán)境中潛在的生物學(xué)后果知之甚少。所以開發(fā)一種操作性強的體外檢測方法來評估這一問題則至關(guān)重要。

由于脫靶相關(guān)的風(fēng)險非常明顯，這不僅促成了各種算法的建立來預(yù)測靶位點脫靶突變的可能性，而且還建立了幾種無偏、通用的技術(shù)來分析全基因組的雙鍵斷裂（DSB）。但現(xiàn)有的主流方法都依賴于某種形式的高通量測序來檢測靶位點或全基因組范圍內(nèi)的突變。而二代測序（NGS）是一種相當(dāng)昂貴的方法，也需要先進(jìn)的生物信息學(xué)技術(shù)來進(jìn)行詳細(xì)的數(shù)據(jù)分析。此外，上述所有算法和方法僅能提供脫靶的位置和頻率信息，而它們對細(xì)胞生理學(xué)的潛在后果仍是未知。目前也缺乏對設(shè)計核酸酶Cas9蛋白潛在長期不良影響的評估方法。

應(yīng)用亮點：

▶  使用naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)構(gòu)建了GEF-dPCR（基因編輯頻率數(shù)字PCR）檢測方法。

▶ dPCR在檢測低頻突變時比NGS具有更高靈敏度和準(zhǔn)確性。

▶ GEF-dPCR可以和NGS互相驗證，GEF-dPCR可能比NGS更不容易受到單核苷酸缺失或交換的影響。

實驗方法：

之前有研究表明NUFF細(xì)胞敲除TP53會導(dǎo)致相對生長優(yōu)勢，作者根據(jù)這種已經(jīng)確立的生長優(yōu)勢設(shè)計了圖1所示的LATE檢測流程。LATE檢測的步驟如下：

１、通過編碼eGFP、 Cas9和gRNA的一體化慢病毒載體LeGO-CC轉(zhuǎn)導(dǎo)NUFF細(xì)胞；

２、轉(zhuǎn)導(dǎo)8-10周后每周通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞的熒光強度；

３、通過定量轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞生長優(yōu)勢指標(biāo)來判斷基因組編輯的影響，陽性結(jié)果中熒光細(xì)胞占絕對優(yōu)勢，陰性結(jié)果中熒光細(xì)胞不存在生長優(yōu)勢。

▲圖１.　LATE檢測原理圖

為了確定LATE檢測是否也可用于評估由非預(yù)期脫靶TP53敲除引起的生長優(yōu)勢，作者篩選了５個靶向其他基因但與TP53具有一定相似性的gRNA，它們含有1到3個與TP53編碼序列的錯配。如表1所示，CYP1A1/2、GFOD、OBSL和RFX gRNA會有一定概率靶向TP53，引起NUFF細(xì)胞的生長優(yōu)勢。

表1.研究使用的gRNA列表及其與TP53外顯子4序列的比對

LATE檢測中的陽性結(jié)果理論上也可能是由非預(yù)期脫靶TP53敲除以外的原因（如插入突變）引起的。為了研究LATE檢測的陽性結(jié)果和（從頭產(chǎn)生的）TP53插入/缺失（indel）之間的聯(lián)系，作者使用naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)設(shè)計了一種新型的GEF-dPCR技術(shù)，又被稱為drop-off檢測。該方法使用兩個雙標(biāo)記的水解探針，可用于定量Cas9介導(dǎo)的DSB修復(fù)期間由非同源末端連接（NHEJ）引起的gRNA結(jié)合位點的indel頻率。HEX標(biāo)記的探針結(jié)合區(qū)域遠(yuǎn)離gRNA識別序列，因此其結(jié)合不受DNA修復(fù)過程影響。FAM標(biāo)記drop-off探針的結(jié)合會被NHEJ產(chǎn)生的indel影響。

實驗結(jié)果：

作者應(yīng)用GEF-dPCR來量化編碼Cas9和CYP1A1、OBSL和RFX gRNA的LeGO CC載體轉(zhuǎn)導(dǎo)NUFF細(xì)胞中脫靶至TP53引入的indel頻率。他們使用了相同的PCR引物和HEX標(biāo)記的探針，并設(shè)計了FAM標(biāo)記的靶標(biāo)特異性drop-off探針（圖3A）。結(jié)果顯示三種gRNA的陽性LATE檢測結(jié)果確實與TP53 indel的增加相關(guān)（圖3C）。值得注意的是，在轉(zhuǎn)導(dǎo)OBSL gRNA的情況下，可檢測到的TP53 indel頻率低至0.2%（圖3C），這種低頻的脫靶效應(yīng)可以通過LATE檢測來定量，并且在所有對照樣本中沒有檢測到類似的TP53外顯子4 突變和indel。這一觀察凸顯了LATE檢測在發(fā)現(xiàn)罕見的促生長事件方面的敏感性，比NGS具有更高靈敏度和準(zhǔn)確性。

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▲圖3 NUFF細(xì)胞獲得的生長優(yōu)勢與TP53中的indel頻率相關(guān)。（A）用于GEF-dPCR的TP53外顯子4和互補的FAM和HEX標(biāo)記探針片段如圖所示。FAM標(biāo)記的探針結(jié)合gRNA靶向Cas9的位置，因此當(dāng)TP53序列的互補區(qū)域內(nèi)沒有indel時能夠結(jié)合。HEX標(biāo)記探針結(jié)合Cas9切割位點外的TP53序列。（B）在指定時間點從NUFF細(xì)胞中獲得基因組DNA樣品，這些細(xì)胞在三個不同的MOI下轉(zhuǎn)導(dǎo)了編碼eGFP，Cas9和靶向TP53 gRNA（LeGO-CC-p53）的一體化慢病毒顆粒（LeGO-CC-p53）。通過GEF-dPCR定量一段時間內(nèi)靶向TP53外顯子4的indel頻率。（C）在指定的時間點從NUFF細(xì)胞中獲得基因組DNA樣品，這些細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)了編碼靶向Cas9及CYP1A1，OBSL1或RFX1的gRNA一體化慢病毒顆粒。通過GEF-dPCR定量一段時間內(nèi)非預(yù)期脫靶TP53外顯子4敲除的indel頻率。（D）用LeGO-CC-p53治療后第7天和第53天對TP53外顯子4進(jìn)行深度測序得到的indel長度及頻率。

為了增加CRISPR/Cas9系統(tǒng)的靶向特異性，Cas9核酸酶一直是優(yōu)化的重點�？茖W(xué)家對SpCas9一直在進(jìn)行結(jié)構(gòu)設(shè)計的修改以及隨機誘變。有研究表明正電荷殘基（K855A）的單個丙氨酸取代可以降低Cas9脫靶活性。作者通過病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)靶向TP53分析SpCas9 K855A的核酸酶特異性。如圖6A所示，在實驗前10天，經(jīng)SpCas9 K855A和wt Cas9處理細(xì)胞的eGFP陽性細(xì)胞生長動力學(xué)接近，但隨著時間的推移SpCas9 K855A處理的eGFP陽性細(xì)胞數(shù)量更多。作者通過GEF-dPCR和深度擴增子測序這兩種技術(shù)都證實，隨著時間的推移TP53中攜帶indel的細(xì)胞數(shù)量不斷增加。GEF-dPCR檢測到轉(zhuǎn)導(dǎo)52天后最高插入indel頻率為65%（圖6B），在轉(zhuǎn)導(dǎo)后第55天約80%的NGS讀數(shù)檢測到indel。有趣的是當(dāng)SpCas9 K855A與CYP1A1（非靶向TP53）gRNA一起使用時，與用相同gRNA和wt Cas9處理的NUFF細(xì)胞相比，eGFP陽性細(xì)胞的比例生長慢得多（圖6A），這應(yīng)該與SpCas 9 K855A特異性的提高有關(guān)。

在第二組實驗中，作者對eSpCas9 1.0（特異性優(yōu)于SpCas 9 K855A）進(jìn)行了上述相同的分析，在LATE試驗中沒有觀察到CYP1A1 gRNA脫靶TP53的eGFP陽性細(xì)胞的生長，而靶向TP53的ｇＲＮＡ與wt Cas9一樣有效（圖6A）。

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▲圖6 LATE檢測區(qū)分具有不同保真度的 SpCas9變體。（A）NUFF細(xì)胞與編碼野生型wt SpCas9（灰色）或存在突變位點的SpCas9（黑色）的多合一LeGO-CC顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)的NUFF細(xì)胞的FC分析比較。紅線標(biāo)記編碼突變 SpCas9 變體的載體的初始轉(zhuǎn)導(dǎo)率。陽性和陰性分別用黃色和藍(lán)灰色表示。（B） 通過 GEF-dPCR 檢測靶向TP53和非靶向 TP53（CYP1A1） 外顯子 4的indel隨時間推移的相對數(shù)量。

結(jié)論：

這里介紹的LATE檢測結(jié)合GEF-dPCR技術(shù)可以填補基因編輯中的部分空白，作為一種簡單，快速和高性價比的方法，用于測試給定基因組編輯策略對細(xì)胞生長調(diào)節(jié)的不良影響，評估不同的Cas9核酸酶在基因組編輯時的特異性。

原文鏈接如下：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8399046/#bib33

期刊介紹：

《molecular therapy》是發(fā)布分子和細(xì)胞療法在糾正遺傳和獲得性疾病研究成果的國際領(lǐng)先期刊。文章涉及基因轉(zhuǎn)移和編輯、載體開發(fā)和設(shè)計、干細(xì)胞操作、疫苗開發(fā)、臨床前靶點驗證、安全性/有效性研究和臨床試驗方面等研究領(lǐng)域。