The American Journal of GASTROENTEROLOGY (IF=10.241)

10位原發(fā)性硬化性膽管炎患者的糞便微生物移植：一個試點(diǎn)的臨床試驗

研究背景
百趣代謝組學(xué)分享，原發(fā)性硬化性膽管炎（Primary sclerosing cholangitis，PSC）是慢性膽汁淤積性疾病，其特征為肝內(nèi)外膽管進(jìn)行性炎癥和纖維化，進(jìn)而導(dǎo)致多灶性膽管狹窄。大多數(shù)患者最終發(fā)展為肝硬化、門靜脈高壓和肝功能失代償【1,2】。原發(fā)性硬化性膽管炎多見于年輕男性，而且往往與炎性腸病（如潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative colitis，UC）或克羅恩�。–rohn’s disease，CD）），尤其是UC（80%以上）有關(guān)【3】。用于治療UC的藥物尚未有效地降低炎癥或緩解PSC的發(fā)生發(fā)展【4，5】。

目前市場上沒有藥物通過食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)用于PSC治療。百趣代謝組學(xué)分享，最新研究發(fā)現(xiàn)糞便微生物移植（Fecal microbiota transplantation，F(xiàn)MT）改變了復(fù)發(fā)性艱難梭菌（Clostridioides difficile）感染的范式治療手段，為其他慢性疾病的微生態(tài)治療提供了思路【6】。此外，已有研究表明PSC與腸道微生物群的紊亂密切相關(guān)，因此，本研究旨在評估FMT治療PSC患者的安全性，及其引起的肝酶表達(dá)、微生物群落以及膽汁酸代謝變化。

志愿者招募和糞菌移植
本研究通過Brigham and Women’s Hospital倫理審查委員會的倫理審查，以及社會公開招募并取得志愿者的知情同意（NCT02424175），Brigham and Women’s Hospital臨床試驗中心一共將10名PSC志愿者納入FMT干預(yù)研究中。PSC患者的臨床信息可參考Table 1。百趣代謝組學(xué)分享，PSC志愿者人群都有6個月以上的臨床確診記錄以及>1.5X堿性磷酸酶（ALP）表達(dá)，并且進(jìn)行磁共振胰膽管造影確診無肝硬化疾病。此外，排除4個星期內(nèi)使用熊去氧膽酸（ursodeoxycholic acid，UDCA）、2個月內(nèi)使用過抗生素、1個月內(nèi)使用過益生菌或者益生元以及進(jìn)行IBD治療的患者。咪唑硫嘌呤（Azathioprine）和美沙拉嗪（mesalamine/5-ASA）被允許進(jìn)行協(xié)同治療。

糞菌捐獻(xiàn)者篩選主要參考OpenBiome（Somerville）標(biāo)準(zhǔn)從已構(gòu)建的糞菌庫里篩選【7】。簡言之，捐獻(xiàn)者需要進(jìn)行傳染病、細(xì)菌、病毒、真菌和健康調(diào)查【8】。最終篩選出一位合格的糞菌捐獻(xiàn)者進(jìn)行糞菌移植。百趣代謝組學(xué)分享，所有人員在FMT前都不能使用抗生素，之后通過結(jié)腸鏡檢查將90 mL 的菌群微生物定植在右結(jié)腸。后續(xù)分別收集糞菌捐獻(xiàn)者baseline、糞菌受試者baseline和FMT治療后1、4、8、12和24個星期的糞便樣本，一方面進(jìn)行16S rRNA V4區(qū)域的宏基因組學(xué)檢測，另一方面進(jìn)行膽汁酸非靶向代謝組學(xué)檢測（55個膽汁酸：36個非結(jié)合性膽汁酸、12個�；撬峤Y(jié)合性膽汁酸和7個甘氨酸結(jié)合性膽汁酸（Steraloids, Newport, RI）。

FMT后PSC患者血清肝酶變化
經(jīng)過FMT糞菌移植后1、4、8、12和24個星期的觀察，初期臨床結(jié)果表明糞菌移植治療PSC是相對安全的，并無相關(guān)不良臨床事件發(fā)生。百趣代謝組學(xué)分享，如圖1所示，30%（3/10）PSC患者都出現(xiàn)了 ≥ 50%的ALP降低，70%（7/10）PSC患者都出現(xiàn)30%的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）或者天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）的降低。后續(xù)因為有一患者無法忍受不使用UDCA，為了便于數(shù)據(jù)解讀，將其進(jìn)行移除。
 

圖1. 每個患者的血清肝臟酶表達(dá)情況

A）原始血清肝酶強(qiáng)度；B）同baseline標(biāo)準(zhǔn)化的血清肝酶強(qiáng)度。虛線是 50% baseline的強(qiáng)度線。

FMT后PSC患者菌群變化
通過對糞便進(jìn)行16S宏基因組學(xué)測序發(fā)現(xiàn)，如圖2A所示，F(xiàn)MT前PSC患者的多樣性與捐獻(xiàn)者baseline具有顯著性差異（P = 0.0058），F(xiàn)MT一周后PSC患者的多樣性與捐獻(xiàn)者接近而不具有顯著性差異（P = 0.053）。百趣代謝組學(xué)分享，此外，PSC受試者在FMT移植后的多樣性于24周內(nèi)穩(wěn)步保持，并與健康捐獻(xiàn)者接近（如圖2B和2C）。
 

圖2. FMT改善了PSC患者微生物多樣性且與健康捐獻(xiàn)者相似

A）PSC受試FMT前后1周alpha多樣性變化；B）PSC受試者連續(xù)24周alpha多樣性變化；C）PSC受試者與捐獻(xiàn)者的相似度。

為了區(qū)分哪些菌群是FMT移植定植的，作者自定義將移植后的PSC患者糞便菌群分為 control OTUs、rare engrafters、frequent engrafters。control OTUs 是指捐獻(xiàn)者糞便中沒有但PSC患者糞便中有且在糞菌移植后增加的菌，rare engrafters 是指在少于50%PSC患者中經(jīng)FMT移植定植的菌群，frequent engrafters 是指至少在50%PSC患者中經(jīng)FMT移植定植的菌群。

百趣代謝組學(xué)分享，如圖3所示，一共有2204個OTU屬于 engrafter OTUs，其中24個是 frequent engrafters，里面有被報導(dǎo)的菌群，如 Desulfovibrio 和 Faecalibacterium 被發(fā)現(xiàn)在PSC患者中缺失【9，10】，而在FMT后顯著性增加。此外，如圖4所示，frequent engrafters 與ALP含量具有顯著性關(guān)聯(lián)性，而且在24個 frequent engrafters 中產(chǎn)短鏈脂肪酸的菌如屬水平的 Odoribacter、 Alistipes和Erysipelotrichaceae incertae sedis【11】與ALP呈現(xiàn)顯著性負(fù)相關(guān)作用。
 

圖3. FMT后PSC患者中24個顯著性定植菌群
 

圖4. FMT后菌群與血清ALP的相關(guān)性

FMT后PSC患者膽汁酸代謝變化
對PSC患者糞便進(jìn)行膽汁酸非靶向代謝組學(xué)研究，無師監(jiān)督主成分分析（PCA）發(fā)現(xiàn)患者的膽汁酸代謝具有個體特異性（如圖5A），并不能按照FMT移植時間周期進(jìn)行區(qū)分（如圖5B）。百趣代謝組學(xué)分享，有師監(jiān)督分析也無法區(qū)分開FMT移植時間周期，進(jìn)一步表明FMT對個體膽汁酸代謝無顯著性影響。此外，F(xiàn)MT移植前的PSC患者膽汁酸代謝譜與糞菌捐獻(xiàn)者類似（如圖5C）。

圖5. 膽汁酸代謝的主成分分析（PCA）

為了研究血清中ALP含量與膽汁酸的關(guān)聯(lián)：（1）使用多元回歸分析PLS表明ALP含量與代謝物具有顯著性關(guān)聯(lián)（P<0.0001）；（2）使用斯皮爾曼關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)UDCA與肝酶具有顯著性負(fù)相關(guān)作用（r = -0.423 for ALP, r = -0.53 for AST, r = -0.61 for ALT），三級膽汁酸（指從初級膽汁酸通過微生物代謝修飾形成的膽汁酸，如7α/β-異構(gòu)化的鵝去氧膽酸形成UDCA）也與肝酶具有顯著負(fù)相關(guān)作用（r = -0.40 for ALP, r = -0.56 for AST, r = -0.61 for ALT），而氨基結(jié)合性膽汁酸與肝酶具有顯著性正相關(guān)作用（r = 0.39 for ALP, r = 0.41 for AST, and r = 0.43 for ALT）；（3）使用線性擬合模型發(fā)現(xiàn)ALP與三級膽汁酸顯著性負(fù)相關(guān)（P = 0.0028，如圖6A），ALP與�；悄懼�酸和甘氨膽汁酸顯著性正相關(guān)（P = 0.01，如圖6B；P = 0.0004，如圖6C）。

圖6. 糞便膽汁酸與ALP的線性擬合分析

綜上所述，該研究是全球第一個人體糞菌移植FMT進(jìn)行PSC患者干預(yù)治療的試驗。研究初步表明FMT在PSC人群中治療相對安全，百趣代謝組學(xué)分享，但是仍然需要更多的人群進(jìn)行隨機(jī)雙盲試驗進(jìn)行驗證；PSC患者經(jīng)過FMT移植后菌群多樣性增高，定植度高的菌群與血清中降低的ALP具有顯著性關(guān)聯(lián)，未來需要對這些定植度高的菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，并解讀他們在PSC患者體內(nèi)的作用機(jī)制從而為靶向治療提供數(shù)據(jù)支撐。