I型干擾素（IFN-1）病是近年來概念較新的一組疾病，屬于免疫缺陷病中的自身炎癥性疾病，以體內(nèi)I型干擾素過度激活表達(dá)造成炎癥損傷為突出特點(diǎn)，表現(xiàn)為不明原因的全身性炎癥，不易診斷，發(fā)病率低，并且沒有好的治療方法[1]。Aicardi-Goutières（艾卡迪-古特雷斯，簡稱AGS）綜合征便是其中之一。AGS由1984年首次提出，是一種主要影響大腦、免疫系統(tǒng)和皮膚的罕見遺傳疾病，且無法治愈。目前已發(fā)現(xiàn)7種致病基因：TREX1、RNASEH2A、RNASEH2B、RNASEH2C、SAMHD1、ADAR以及IFIH1。

基因缺陷疾病最根本的治愈方法是基因編輯療法，糾正突變的基因，但由于其存在脫靶效應(yīng)、安全性質(zhì)疑、倫理問題等，對全身性基因缺陷疾病進(jìn)行基因編輯仍不現(xiàn)實(shí)，亟需針對AGS的發(fā)病機(jī)理以及分子機(jī)制的進(jìn)一步研究，以設(shè)計(jì)生產(chǎn)出對應(yīng)的治療藥物。

Nature
2022年7月20日，Nature期刊同時(shí)刊登四篇文章均用到Incucyte® 實(shí)時(shí)活細(xì)胞成像分析系統(tǒng)！其中三篇同時(shí)報(bào)道了對AGS綜合征罕見病的重大研究進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)了一種ADAR1突變型AGS綜合征的全新發(fā)病機(jī)制，為治療提供了新的靶點(diǎn)和思路。這三篇文章具體報(bào)道了什么，又是如何應(yīng)用Incucyte® 的呢？

 
 
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下面我們以德國科隆CECAD 研究中心的Manolis Pasparakis教授團(tuán)隊(duì)（第一作者為焦會朋博士和Laurens Wachsmuth博士）發(fā)表的其中一篇題為“ADAR1 averts fatal type I interferon induction by ZBP1”為例詳細(xì)講一講研究的思路以及Incucyte® 在基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用[2]。
 
 
研究背景
ADAR1突變是病因之一。ADAR1蛋白有兩種亞型，核內(nèi)表達(dá)的結(jié)構(gòu)性p110及胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)的含有Zα區(qū)域的p150，p150含有1個(gè)Zα結(jié)構(gòu)域、1個(gè)脫氨酶結(jié)構(gòu)域和3個(gè)dsRNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。脫氨酶結(jié)構(gòu)域催化dsRNA的A-to-I編輯，Zα結(jié)構(gòu)域特異性識別和結(jié)合左旋核酸（Z-nucleic acids，Z-NAs）[3]。大部分的患者編碼該區(qū)域的序列發(fā)生點(diǎn)突變導(dǎo)致人ADAR1中193位的脯氨酸變?yōu)楸�氨酸[4]，且模擬AGS患者小鼠模型表現(xiàn)出MDA5-MAVS依賴的致病性IFN-1應(yīng)答[5]。這就表明ADAR1 Zα結(jié)構(gòu)域同Z-NAs的相互作用能夠抑制致病性IFN-1應(yīng)答。
   
研究結(jié)果
為了模擬人類ADAR1突變誘發(fā)的AGS患者，作者首先構(gòu)建ADAR1 Zα結(jié)構(gòu)域（N175D/Y179A）突變的雜合子小鼠（Adar1mZα/-），該小鼠表現(xiàn)產(chǎn)后致死，伴隨紅細(xì)胞生成缺陷、腸道細(xì)胞大量死亡和不同組織中IFN-1應(yīng)答的上調(diào)，且MAVS-/-完全逆轉(zhuǎn)AGS的病理學(xué)表型，說明依賴于MAVS信號通路，這與之前的研究成果一致。

ZBP1是哺乳動物中除ADAR1外唯一含有Zα結(jié)構(gòu)域的蛋白，是一個(gè)干擾素誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白，在調(diào)控細(xì)胞死亡、抗病毒反應(yīng)、炎癥反應(yīng)和組織穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮重要作用[6]。作者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)ZBP1缺失能夠不完全抑制上述病理表型：產(chǎn)后致死、紅細(xì)胞生成缺陷以及腸道和腎臟病變等。而表現(xiàn)出AGS疾病表型的另一種Adar1雜合及Mavs雜合小鼠，也能被ZBP1敲除不同程度地逆轉(zhuǎn)。綜上所述，ZBP1是促進(jìn)Adar1mZα/-小鼠致病性IFN-1應(yīng)答的關(guān)鍵蛋白。

在這部分結(jié)果中，使用的都是半敲小鼠，在純合敲除小鼠中，發(fā)現(xiàn)大約40%的 Adar1-/- Zbp1-/-Mavs-/-小鼠存活到成年期。探究ZBP1-RIPK3的作用在Adar-/-小鼠中的作用時(shí)，作者分離小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF），與Mavs-/- MEFs相比，少量蛋白質(zhì)翻譯抑制劑CHX處理IFNγ 預(yù)刺激的細(xì)胞（刺激ZBP1表達(dá)）導(dǎo)致Adar1-/-Mavs-/-中的細(xì)胞死亡增加，ZBP1敲除阻止了死亡表型（表1）。說明ZBP1-RIPK3依賴性信號促進(jìn)Adar1-/-Mavs-/-小鼠的MAVS非依賴性病理。
 
表1Incucyte® 統(tǒng)計(jì)的實(shí)時(shí)細(xì)胞死亡的信號強(qiáng)度
 
那ZBP1是如何促進(jìn)Adar1 mZα/-小鼠IFN-1應(yīng)答的呢？Zα結(jié)構(gòu)域可以識別左旋DNA和RNA，是否是通過特異性結(jié)合某種核酸實(shí)現(xiàn)的呢？

TREX1突變誘發(fā)的AGS小鼠模型（Trex1-/-），是通過自身DNA積累激活cGAS-STING，誘發(fā)I型干擾素上調(diào)和心肌炎的[7,8]，且ZBP1確實(shí)對于TREX1突變導(dǎo)致的表現(xiàn)沒有任何影響，這表明ZBP1可能特異性識別ADAR1突變誘發(fā)的左旋RNA的積累來促進(jìn)病理表型的。RNA高通量測序（RNA-seq）發(fā)現(xiàn)小鼠內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄元件表達(dá)的上調(diào)和A-to-I編輯的下調(diào)，dsRNA在體內(nèi)的積累，為ZBP1的激活提供了特異性的配體。ZBP1 Zα結(jié)構(gòu)域的突變能夠抑制Adar1mZα/-小鼠的病理表型，證實(shí)ZBP1通過結(jié)合小鼠中積累的內(nèi)源性Z-RNA促進(jìn)疾病表型。
 
ZBP1結(jié)合Z-RNA以后又是如何激活下游信號通路，調(diào)控IFN-1應(yīng)答，進(jìn)而促進(jìn)疾病表型的呢？
 
之前的研究表明ZBP1可以誘發(fā)的RIPK3依賴的FADD-Caspase-8介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡（apoptosis）、MLKL介導(dǎo)的程序性細(xì)胞壞死（necroptosis）以及RIPK1介導(dǎo)的促炎反應(yīng)[9]，作者對已有的研究結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)Ripk3-/-、Mlkl-/-、Fadd-/- Mlkl-/-、Fadd-/- Ripk3-/-和Ripk1mR/mRMlkl-/-等突變都無法逆轉(zhuǎn)Adar mZα/-小鼠的病理表型，這表明ZBP1促進(jìn)致病性I型干擾素應(yīng)答與已有的信號通路無關(guān)，具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。
 
結(jié)論
在這篇文章中，研究人員發(fā)現(xiàn)ZBP1是促進(jìn)ADAR1 Zα結(jié)構(gòu)域突變的半合子小鼠（Adar1 mZα/-）引起的致病性I型干擾素應(yīng)答的關(guān)鍵分子，為治療提供了新的靶點(diǎn)，并且提出存在一種不依賴于細(xì)胞死亡的全新致病機(jī)制的可能。
 
 
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同樣，來自華盛頓大學(xué)的Andrew Oberst團(tuán)隊(duì)發(fā)表題為“ADAR1 mutation causes ZBP1-dependent immunopathology”的文章[10]，他們也發(fā)現(xiàn)ADAR1致病是由ZBP1激活驅(qū)動的，但ZBP1激活導(dǎo)致細(xì)胞死亡是由于PIPK3和MLKL的磷酸化，且依賴于caspase 8，這與焦博士的結(jié)論有所不同。

在研究下游通路的過程中，作者使用Incucyte® 對密集時(shí)間點(diǎn)的實(shí)時(shí)細(xì)胞死亡情況進(jìn)行檢測，提供了可靠的數(shù)據(jù)支持。下面為文中利用Incucyte® 做出的結(jié)果：
 
為了探索ADAR1改變激活的ZBP1下游通路，用半胱天冬酶抑制劑zVAD處理它們會導(dǎo)致ZBP1依賴性RIPK3磷酸化和細(xì)胞死亡，加入PIPK3磷酸化抑制劑GSK843逆轉(zhuǎn)細(xì)胞死亡表型（圖2），證明Adar P195A/p150null細(xì)胞對ZBP1依賴性壞死性凋亡敏感。
 

圖2Caspase抑制劑zVAD處理8小時(shí)后（激活PIPK3依賴性細(xì)胞死亡），使用Incucyte® 測量細(xì)胞死亡。
 
同時(shí)ADAR1的缺失也激活ZBP1介導(dǎo)的caspase-8依賴的凋亡和MLKL依賴的壞死性凋亡。為了證明ZBP1與RIPK1相互作用激活caspase-8依賴性細(xì)胞凋亡，作者設(shè)計(jì)了一種直接巧妙的激活ZBP1的還原系統(tǒng)，用衍生自蛋白質(zhì)FK506的串聯(lián)誘導(dǎo)型二聚化結(jié)構(gòu)域替換ZBP1的ZBD，使用可滲透細(xì)胞的小分子B/B激活。實(shí)驗(yàn)表明，盡管RIPK3促進(jìn) ZBP1 依賴性細(xì)胞凋亡，但在沒有RIPK3的情況下，ZBP1仍然可以驅(qū)動caspase-8依賴性細(xì)胞死亡反應(yīng)（圖3）。
 

圖3 Incucyte® 檢測死亡細(xì)胞比例
 
 
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這還沒結(jié)束，比利時(shí)的Jonathan Maelfait團(tuán)隊(duì)也發(fā)表一篇Nature文章“ ADAR1 prevents autoinflammation by suppressing spontaneous ZBP1 activation”[11]，該文章的亮點(diǎn)是：ADAR1改變導(dǎo)致dsRNA形成，與ZBP1結(jié)合自激活，而ZBP1激活會導(dǎo)致caspase-8依賴性細(xì)胞凋亡和MLKL介導(dǎo)的ADAR1缺陷細(xì)胞的壞死性凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致胚胎致死表型。

為了確定哪些信號通路導(dǎo)致ADAR1缺陷細(xì)胞死亡，用IFNα處理原代小鼠肺成纖維細(xì)胞以誘導(dǎo)ZBP1表達(dá)，為了排除自發(fā)MDA5和MAVS或TNF信號傳導(dǎo)對細(xì)胞存活的混雜影響，加入TNF中和抗體。用IFNα和蛋白質(zhì)合成抑制劑放線菌酮 (CHX) 刺激 ADAR1 缺陷型成纖維細(xì)胞，增強(qiáng)TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，誘導(dǎo)ZBP1介導(dǎo)的細(xì)胞死亡（圖4）。結(jié)果證明ZBP1激活導(dǎo)致RIPK3的募集，從而誘導(dǎo)RIPK1-FADD-caspase-8介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和MLKL介導(dǎo)的壞死性凋亡的平行途徑。
 

圖4 Incucyte® 實(shí)時(shí)檢測原代小鼠肺成纖維細(xì)胞死亡
 
為了測試dsRNA結(jié)構(gòu)是否能刺激ZBP1，研究者將來自NICN1和BPNT1 mRNA的3'UTR的轉(zhuǎn)錄Alu-Alu雜合體體外轉(zhuǎn)染到表達(dá)人ZBP1的HT-29細(xì)胞中。兩種Alu-Alu雜交體都強(qiáng)烈誘導(dǎo)ZBP1依賴性細(xì)胞死亡，這依賴于完整的ZBP1 Zα結(jié)構(gòu)域，并且可以被zVAD-FMK抑制，并且與GSK’84聯(lián)合對細(xì)胞死亡的抑制效果更強(qiáng)（圖5）。
 

圖5 dsRNA誘導(dǎo)ZBP1突變細(xì)胞死亡，Incucyte® 檢測死亡陽性細(xì)胞比例
 
這三篇Nature文章同時(shí)揭示了ADAR1改變導(dǎo)致AGS綜合征是由于ZBP1的激活引發(fā)的全新機(jī)制，盡管研究后續(xù)信號通路時(shí)結(jié)論有所不同，但都進(jìn)一步支持ZBP1是哺乳動物dsRNA的感受器的觀點(diǎn)。
 
 
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除了以上三篇，同一天還有第四篇Nature文章“Mechanisms of APOBEC3 mutagenesis in human cancer cells”，來自美國的MIT和哈佛大學(xué)博德研究院John Maciejowski團(tuán)隊(duì)。研究人員建立了單堿基置換（single-base substitutions，簡稱SBS）特征標(biāo)簽與人類腫瘤細(xì)胞基因組上內(nèi)源性APOBEC3之間的聯(lián)系[12]，在這篇文章中，腫瘤細(xì)胞的增殖能力強(qiáng)，可以進(jìn)行長時(shí)間的觀察，研究者利用Incucyte® 連續(xù)監(jiān)測了20天（480h!!!）細(xì)胞的增殖情況（圖6）。
 

圖6 Incucyte® 以匯合度(Confluence)實(shí)時(shí)檢測REV1敲除后細(xì)胞的增殖

Summary

總而言之，在上述研究中體現(xiàn)出Incucyte®長時(shí)程活細(xì)胞成像與分析系統(tǒng)獨(dú)特優(yōu)勢：

自動檢測，提升實(shí)驗(yàn)效率：滿足密集時(shí)間點(diǎn)以及長時(shí)間監(jiān)測的需求，一次實(shí)驗(yàn)得到大量數(shù)據(jù)，解放人力，是從事細(xì)胞研究不可或缺的工具；

分析簡便，提升數(shù)據(jù)質(zhì)量：軟件采集及分析模塊配合熒光檢測試劑，得到高度可靠的數(shù)據(jù)。實(shí)時(shí)檢測整個(gè)細(xì)胞死亡/凋亡曲線，在細(xì)胞死亡狀況較為接近的情況下，仍然在大量數(shù)據(jù)的前提下得到確切的結(jié)論；

6板位設(shè)計(jì)，多實(shí)驗(yàn)同步開展：內(nèi)設(shè)6個(gè)板位，可以分別獨(dú)立設(shè)置檢測程序，滿足6組不同實(shí)驗(yàn)或多人實(shí)驗(yàn)同時(shí)檢測的需求。
 
Download - 參考文獻(xiàn) - 
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