小小身體蘊(yùn)含大大能量！前列腺癌非侵入性的診斷和監(jiān)測的新方式——胞外囊泡（外泌體）代謝組學(xué)！目前，胞外囊泡/外泌體作為非侵入性的癌生物標(biāo)志物已成為新的研究熱點(diǎn)。百趣代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，芬蘭赫爾辛基大學(xué)學(xué)者M(jìn)aija Puhka在期刊 Theranostics（IF=8.85）上發(fā)表了相關(guān)文章，下面我們一起來看看吧！
 

作者：Maija Puhka  芬蘭 赫爾辛基大學(xué)
期刊：Theranostics
影響因子：8.85

1研究背景
胞外囊泡（EVs）是一種很有前景的生物標(biāo)志物來源。代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，近些年來研究的熱點(diǎn)-外泌體就是一種直徑在40-100nm的盤狀囊泡，在許多研究，特別是針對癌癥的研究，都集中在EVs的RNA和蛋白質(zhì)載體上，其中有一些EVs來源的癌癥生物標(biāo)志物已經(jīng)在臨床上使用，除此之外，在脂質(zhì)、DNA和糖蛋白分析方面也有新的進(jìn)展。

由于癌細(xì)胞會比正常細(xì)胞分泌更多的囊泡，因此通過研究體液中EVs代謝物的含量變化可以提供一種檢測癌癥動態(tài)相關(guān)生物標(biāo)志物的方法，EVs在前列腺癌和其他癌細(xì)胞的代謝控制中起到了重要的作用。代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，本文研究了尿液和血小板EVs中的小分子代謝物水平，并采用不同的歸一化方法，分析比較了前列腺切除前后前列腺癌（Pca）患者和健康對照組的尿液EVs（UEVs）樣本。

2研究方法
1. 采用靶向超高效液相色譜法質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLC-MS），分析原始尿樣、血小板及其分離的EVs中的一百多種代謝物。
2. 確定了EVs富集的代謝產(chǎn)物后通過數(shù)據(jù)庫搜索分析其亞細(xì)胞來源、途徑和相關(guān)酶或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
3. 比較了前列腺切除前后前列腺癌（Pca）患者和健康對照組的尿液EVs（UEVs）樣本，檢測EVs及尿液來源因子及代謝物間比率，以確定組學(xué)數(shù)據(jù)的歸一化分析方法。

3研究結(jié)果
1. 對EVs的分離及驗(yàn)證
采用差速離心的方法對尿液或血小板濃縮物分離得到EVs樣品，并利用EM（電子顯微鏡）、Western blotting（蛋白免疫印跡）和NTA（納米粒子跟蹤分析）對分離得到的EVs樣品進(jìn)行了驗(yàn)證，EM觀察到的大多數(shù)UEVs具有單個(gè)膜的球狀體，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)一些多膜層EVs；WB表明UEVs中無細(xì)胞碎片，用NTA測定的單個(gè)樣品中，UEVs的尺寸分布變化不明顯。綜上表明：分離得到的EVs樣品中有足夠純度的EVs。
 

圖1.EV樣品的分離驗(yàn)證

（A. EM顯示UEVs典型的圓形形態(tài)和大小范圍；B.偶爾見到多膜層的UEVs；C-D.EVs標(biāo)志物CD59和CD63的免疫標(biāo)記顯示；E. EM圖像中UEVs的大小分布表明；F. 經(jīng)EM觀察，血小板EVs(PEVs)具有典型的形態(tài)特征；G.UEVs分離的WB驗(yàn)證。）
 

圖2. 應(yīng)用WB法和NTA法對UEVs樣品進(jìn)行代謝組學(xué)表征

（A. 用EVs標(biāo)記物對UEVs樣本進(jìn)行Western blotting；B. UEVs濃度的NTA分析；C.UEVs的尺寸分布）

2. 靶向代謝組檢測所需最低EVs量的確定
在檢測過程中發(fā)現(xiàn)，對于1×109EVs，大多數(shù)代謝物仍低于檢測限，在分析1010EVs時(shí)，結(jié)果顯示大多數(shù)代謝物高于檢測限。在UEVs樣本中，102種代謝物中有40-82種（39-80%）高于檢出限，32-55種（31-54%）高于定量限，在PEVs樣品中，111種代謝物中有62種（56%）被檢出，41種（37%）高于定量限。

3. 尿液、血小板EVs中主要代謝產(chǎn)物類別、途徑及其濃度
EVs中常見的代謝物可以分為五類：1）有機(jī)酸及其衍生物，2）核苷酸、糖和衍生物，3）肉堿，4）維生素B/相關(guān)代謝物，5）胺。分別分析了所有UEVs或PEVs中被定量的化合物，進(jìn)行了代謝物富集分析，并使用代謝物摩爾質(zhì)量除以EVs總體積以計(jì)算EVs中代謝物的濃度。代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，結(jié)果表明：不同來源的EVs代謝譜具有相似性，但是也表現(xiàn)出明顯的差異，EVs中含有能夠富集到多種通路的物質(zhì)，且其中某些物質(zhì)具有較高濃度。
 

圖3. UEV和PEV中代謝物含量及途徑的比較

（A.UEVs和PEVs中高于定量限的代謝物韋恩圖分析；B.代謝物富集分析）

4. 尿液、血小板EVs代謝物的重疊及差異
尿液、血小板及其分離EVs中的代謝產(chǎn)物存在重疊，但也存在各自特有的代謝產(chǎn)物。在所有尿液樣本中，83個(gè)高于檢測限的代謝物中，有36個(gè)（43%）在所有對照UEVs樣本中被檢測到，在所有血小板樣本中檢測到的51種代謝物中，有47種（92%）也在所有PEVs中檢測到。代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，結(jié)果表明：分離的EVs和對應(yīng)的來源樣本中的代謝物譜是有重疊的，但在定性和定量上卻有明顯差異，這表明我們成功地純化了EVs，并對其EVs內(nèi)代謝物進(jìn)行了分析。
 

圖4. EVs中代謝物含量與其來源的韋恩圖比較

5. EVs中特定代謝物與已報(bào)道的EVs中存在的酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有較好的相關(guān)
確定EVs富含的代謝產(chǎn)物后通過數(shù)據(jù)庫分析其亞細(xì)胞來源。結(jié)果表明：EVs豐富了一系列細(xì)胞溶質(zhì)代謝物，其中包括核苷酸和亞精胺途徑的產(chǎn)物，這些產(chǎn)物與許多EVs駐留酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)。
 

圖5. EVs代謝物的亞細(xì)胞定位

6. 采用不同的歸一化方法比較前列腺癌中EVs代謝物含量的變化
對前列腺癌患者手術(shù)前后及健康人的尿液EVs進(jìn)行了比較，并利用EVs的體積、數(shù)量和CD9光密度對數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化，得到了相似的結(jié)果。代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，結(jié)果表明：前列腺癌患者的腺苷、葡萄糖醛酸鹽、異丁酰-L-肉堿和D-核糖5-磷酸含量均低于健康對照組和前列腺切除后尿液樣品的2-26倍（P＜0.05），這些變化僅能在EVs來源的因子或與代謝物的比值中被發(fā)現(xiàn)，在原尿樣品中則不存在，與EVs來源因子和代謝物比率歸一化相比，尿量或肌酐歸一化沒有顯著差別，說明對EVs衍生因子的歸一化或代謝物比率的分析最有可能揭示EVs代謝物譜中與癌癥相關(guān)的變化。
 

圖6. 前列腺癌中UEVs中代謝物顯著變化

（A.將單個(gè)UEVs中代謝物濃度歸一化為CD9的OD值；B. 兩種代謝物之間的比率表明在前列腺切除術(shù)前的樣本中代謝物的變化）

4 結(jié)論
研究表明：不同來源樣本的EVs代謝物分析可以采用高通量的平臺，而且僅需要相對少量的樣品材料。代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，通過代謝物的特異性富集及歸一化方法的應(yīng)用，利用EVs代謝組學(xué)其代謝產(chǎn)物可以通過不分析原始的EVs來源物質(zhì)，而直接獲得新的生物標(biāo)志物。EVs代謝組學(xué)可以提供一種新的非侵入性和高通量工具，用來監(jiān)測前列腺癌或其他疾病。