發(fā)表期刊：Cell Metabolism
影響因子：22.415
發(fā)表時(shí)間：2019年5月30日
合作單位：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)

Biotree協(xié)助客戶中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)吳緬教授和安徽醫(yī)科大學(xué)胡汪來(lái)教授及其研究團(tuán)隊(duì)在國(guó)際頂尖期刊《Cell Metabolism》上發(fā)表名為“CircACC1 Regulates Assembly and Activation of AMPK Complex under Metabolic Stress ”的研究成果。CircRNA+代謝組，如何研究才能發(fā)表在IF=22.415的頂級(jí)期刊上？下面小趣和大家一起學(xué)習(xí)下這篇文章的精彩之處。

研究背景

AMPK（AMP活化蛋白激酶）是維持能量平衡的重要代謝酶之一，是細(xì)胞能量狀態(tài)關(guān)鍵感受器，平衡細(xì)胞的合成和分解，在控制脂肪酸氧化、糖酵解和脂解作用中起重要作用。百趣代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，AMPK已在2型糖尿病和代謝綜合征中得到廣泛研究，被視為癌癥治療重要的潛在靶點(diǎn)。目前對(duì)于非編碼RNA調(diào)控AMPK的研究有限，已有報(bào)道LncRNA參與調(diào)控AMPK，但CircRNA是否參與AMPK調(diào)控卻尚未研究。

研究結(jié)果

1. CircACC1的發(fā)現(xiàn)和鑒定

作者試圖找到與脂質(zhì)代謝相關(guān)的circRNA，首先找出與脂質(zhì)代謝有關(guān)的91個(gè)基因，結(jié)合前人研究過(guò)的1444個(gè)circRNAs，篩選出了6個(gè)候選基因，7個(gè)circRNAs。然后作者在HCT細(xì)胞中用RNA酶消化后，RT-PCR檢測(cè)7種circRNAs的表達(dá)水平，7種circRNAs都有表達(dá)。百趣代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，用siRNA抑制每個(gè)circRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)只有抑制circACC1時(shí)會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)積累，證明了circACC1與脂質(zhì)代謝相關(guān)。

circACC1是來(lái)源于人類17號(hào)染色體的ACC1基因，與小鼠序列沒(méi)有同源性，后面Northern雜交的試驗(yàn)也驗(yàn)證了是環(huán)狀的RNA。用RNase R處理對(duì)Total RNA進(jìn)行qPCR分析，結(jié)果表明circACC1和CDR1未被降解，而β-actin和ACC1 mRNA被降解。百趣代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，Actinomycin D處理結(jié)果也表明circACC1比ACC1 mRNA更穩(wěn)定。這些都證明circACC1確實(shí)是環(huán)狀的RNA。
 

圖1. CircACC1的鑒定及參與脂質(zhì)代謝

2.CircACC1促進(jìn)糖酵解和脂肪酸氧化
為了進(jìn)一步研究circACC1的功能，作者在LO2（人正常肝細(xì)胞系）細(xì)胞中敲低circACC1發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)含量升高。相反，在HCT116和LO2中過(guò)表達(dá)circACC1則脂質(zhì)含量降低。circACC1的敲除或超表達(dá)對(duì)ACC1 mRNA和ACC1蛋白水平?jīng)]有影響。百趣代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，對(duì)circACC1沉默后細(xì)胞中的脂質(zhì)成分進(jìn)行代謝組分析，包括用LC-MS分析脂質(zhì)代謝及GC-MS檢測(cè)游離脂肪酸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)及游離脂肪酸含量顯著增高。

AMPK是維持能量平衡的重要樞紐，在能量應(yīng)激中，AMPK通過(guò)磷酸化PFK-2從而促進(jìn)糖酵解， 通過(guò)磷酸化ACC1抑制脂肪酸合成。敲低circACC1抑制了ACC1和PFKFB3的磷酸化，過(guò)表達(dá)circACC1促進(jìn)PFKFB3的磷酸化。沉默circACC1后細(xì)胞中ATP、NADPH和胞外乳酸含量均增加，同時(shí)增加了ROS水平，而超表達(dá)circACC1后結(jié)果完全相反。這些數(shù)據(jù)表明circACC1可以增強(qiáng)AMPK的活性，從而促進(jìn)糖酵解和脂肪酸的氧化。
 

圖2. CircACC1促進(jìn)糖酵解和脂肪酸氧化
 

3.CircACC1直接與AMPK的 β 和 γ 亞基結(jié)合

上述結(jié)果表明circACC1可以調(diào)控AMPK，那么它們是如何相互作用的呢？作者進(jìn)行了進(jìn)一步研究。FISH試驗(yàn)表明AMPK和circACC1都存在于細(xì)胞質(zhì)中。Pull-down試驗(yàn)表明AMPK的每一個(gè)亞單位都可以用反義探針選擇性地捕獲。百趣代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，RNA免疫沉淀（RIP）分析表明，circACC1與AMPK β1和γ1亞單位有很強(qiáng)的相互作用，但與ɑ1的結(jié)合很小。

在此基礎(chǔ)上，作者進(jìn)一步研究circACC1與AMPK β1和γ1的相互作用是否與全酶有關(guān)。百趣代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，兩步免疫共沉淀均可檢測(cè)到circACC1和AMPK3個(gè)亞基。體外EMSA實(shí)驗(yàn)表明只有AMPK β1和γ1能與circACC1進(jìn)行共沉淀，而ɑ1不能。將P1段拆分為P1和P2兩段，最終研究發(fā)現(xiàn)P1段是circACC1與AMPK β 和 γ 結(jié)合位點(diǎn)。
 

圖3. CircACC1與AMPK的 β 和 γ 亞基直接結(jié)合
 

4.CircACC1提高AMPK全酶的穩(wěn)定性和活性

上面的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敲低circACC1導(dǎo)致AMPK三個(gè)亞基水平均降低，蛋白酶體抑制劑能恢復(fù)因敲低circACC1導(dǎo)致的AMPK水平下調(diào)，表明circACC1影響AMPK蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。百趣代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，circACC1敲低顯著降低了AMPK的半衰期，增加AMPK亞基多聚泛素化水平。單獨(dú)敲除AMPK的三個(gè)亞基會(huì)導(dǎo)致其他亞基水平大大降低。用MG132穩(wěn)定蛋白水平后，敲除circACC1后AMPK亞基間結(jié)合能力下降，表明circACC1可以提高AMPK全酶的穩(wěn)定性。作者同時(shí)用哺乳動(dòng)物雙雜交試驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，結(jié)果表明circACC1沉默使AMPK β1和γ1結(jié)合作用降低，超表達(dá)circACC1使AMPK β1和γ1結(jié)合能力增強(qiáng)。
 

圖4. CircACC1提高AMPK全酶的穩(wěn)定性和活性

5. CircACC1直接調(diào)控AMPK的活性

AMPK在維持能量平衡中起著非常重要的調(diào)控作用，可以感知和響應(yīng)細(xì)胞能量和營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的變化。那么不同的應(yīng)激條件是如何影響circACC1的表達(dá)呢？RT-PCR結(jié)果分析表明，血清饑餓狀態(tài)能刺激circACC1的表達(dá)以及pre-ACC1的生成，但是對(duì)成熟circACC1 mRNA的表達(dá)水平并無(wú)影響。隨后補(bǔ)充血清發(fā)現(xiàn)circACC1的水平也隨之降低，說(shuō)明circACC1 受到血清水平有效的調(diào)節(jié)。

百趣代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，AMPK的活性受幾種激酶的調(diào)控，包括LKB1，CaMKK2和TAK1。那么circACC1是否是通過(guò)這些激酶調(diào)節(jié)AMPK的活性呢？作者對(duì)此也進(jìn)行了研究，敲除LKB1、CaMKK2和TAK1確實(shí)能夠降低AMPK和PFKFB3的活性，并降低了ACC1磷酸化。然后分別干涉LKB1、CaMKK2和TAK1，超表達(dá)circACC1，發(fā)現(xiàn)AMPK活性增強(qiáng)，而不受三種激酶表達(dá)的影響。說(shuō)明circACC1可以直接調(diào)節(jié)AMPK的活性，而不是通過(guò)激酶調(diào)節(jié)。
 

圖5. CircACC1調(diào)控AMPK的活性

6.在血清饑餓狀態(tài)下C-Jun促進(jìn)CircACC1的表達(dá)

對(duì)ACC1的啟動(dòng)子進(jìn)行分析，有CEBPA、c-Jun、CREB1和SREBF1結(jié)合位點(diǎn)，為了確定這些轉(zhuǎn)錄因子是否參與circACC1的調(diào)控，作者分別對(duì)這些轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行敲除研究，發(fā)現(xiàn)只有c-Jun的沉默會(huì)顯著降低circACC1的表達(dá)，表明c-Jun參與了circACC1的調(diào)控。百趣代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，隨后作者用CHIP試驗(yàn)和熒光素酶報(bào)告驗(yàn)證了c-Jun與ACC1啟動(dòng)子的結(jié)合。血清饑餓后誘導(dǎo)c-Jun激活，JNK和 AMPK信號(hào)增強(qiáng)，ACC1的水平降低。干涉c-Jun后AMPK和PFK2活性降低，超表達(dá) circACC1后其活性恢復(fù)，這些研究表明c-Jun可促進(jìn)circACC1的表達(dá)，增強(qiáng)AMPK活性。
 

圖6. 在血清饑餓狀態(tài)下C-Jun促進(jìn)CircACC1的表達(dá)
 

7.CircACC1的發(fā)現(xiàn)在腫瘤治療中的意義

那么circACC1的發(fā)現(xiàn)在腫瘤治療中有什么意義呢？在HCT116細(xì)胞中沉默circACC1抑制了細(xì)胞的增殖，超表達(dá)circACC1促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。作者同時(shí)也測(cè)定了結(jié)腸癌組織及鄰近非癌組織中circACC1表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織circACC1的表達(dá)水平顯著高于正常組織，多數(shù)癌癥組織中c-Jun和AMPK水平也高于正常組織。百趣代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，circACC1的表達(dá)與c-Jun和AMPK的活性呈正相關(guān)。
 

圖7. CircACC1在腫瘤發(fā)生中的意義
 

總結(jié)

本研究首先篩選和鑒定與脂質(zhì)代謝相關(guān)的circRNA—circACC1，代謝組方面包括用LC-MS檢測(cè)脂質(zhì)代謝組及用GC-MS檢測(cè)游離脂肪酸。然后通過(guò)基因敲除試驗(yàn)證實(shí)circACC1調(diào)控AMPK，進(jìn)一步分析circACC1與AMPK相互作用的機(jī)理，即circACC1直接與AMPK的 β 和 γ 亞基結(jié)合。百趣代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，基因敲除試驗(yàn)和哺乳動(dòng)物雙雜交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)circACC1提高AMPK全酶的穩(wěn)定性和活性。作者還對(duì)ACC1的啟動(dòng)子進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)c-Jun與ACC1啟動(dòng)子結(jié)合，c-Jun可促進(jìn)circACC1的表達(dá)。最后探索在腫瘤發(fā)生中的意義，發(fā)現(xiàn)沉默circACC1能抑制了細(xì)胞的增殖，結(jié)腸癌組織中circACC1的水平也顯著高于正常組織。百趣代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，本文研究思路嚴(yán)謹(jǐn)縝密，試驗(yàn)設(shè)計(jì)環(huán)環(huán)相扣，層層遞進(jìn)，每步都有充足的試驗(yàn)驗(yàn)證，工作量之大讓人嘆服，值得學(xué)習(xí)。

本次研究，BIOTREE協(xié)助老師們進(jìn)行了經(jīng)典脂質(zhì)組學(xué)及游離脂肪酸高通量靶標(biāo)定量檢測(cè)，文章的最后，老師們也對(duì)BIOTREE進(jìn)行了致謝，謝謝老師們的認(rèn)可，客戶的認(rèn)同是BIOTREE前行最大的動(dòng)力！