腦疾病病人的腦脊液（CSF）通常用來(lái)診斷和監(jiān)測(cè)研究，但是惡性膠質(zhì)瘤病人腦脊液組成的變化很少被人們所知。該研究作者建立了靶向代謝組學(xué)分析方法，采用SRM監(jiān)測(cè)模式，使用正負(fù)離子切換的方法在CSF中鑒定到了124種極性代謝物。樣品來(lái)源于10例膠質(zhì)瘤病人與7例對(duì)照。百趣代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，采用多種統(tǒng)計(jì)手段對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，為神經(jīng)性疾病生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)提供參考。

10位膠質(zhì)瘤病人包含4例新診斷的膠質(zhì)瘤病人及6例復(fù)發(fā)病人。7例對(duì)照未診斷出任何膠質(zhì)瘤。除了3號(hào)病人通過腦室采集CSF外，其余均通過腰椎穿刺采集。樣品采自27-67歲的男性和女性患者，樣品保存于-80℃冰箱直至測(cè)定。百趣代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，同時(shí)測(cè)定了一些臨床指標(biāo)如白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血清總蛋白水平、血糖水平、LDH水平等（見表1）。測(cè)定的腫瘤指標(biāo)包括腫瘤進(jìn)程、生存期、腫瘤大小等。

對(duì)于CSF的前處理，作者向250μL腦脊液樣品中加入80%甲醇，-20℃下沉淀蛋白過夜。之后在4℃下13000rpm離心10min。取上清液吹干，用50μL水-乙腈（95:5）復(fù)溶。13000rpm離心5min，取上清液吹干，保存于-80℃冰箱。樣品用20μL水（質(zhì)譜級(jí)）復(fù)溶，取10μL進(jìn)液質(zhì)分析。

表1膠質(zhì)瘤病人的基本信息及臨床參數(shù)

靶向分析的LC-MS/MS條件如下：采用QTRAP 5500（AB/SCIEX）和UFLC （島津）分析系統(tǒng)。質(zhì)譜共設(shè)定了285個(gè)SRM離子對(duì)，并采用正負(fù)離子切換的模式檢測(cè)。百趣代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，噴嘴電壓（正離子模式）：+4900V，噴嘴電壓（負(fù)離子模式）：-4500V；源溫：475℃； dwell time：4ms； cycle time：1.89s；色譜柱采用Luna NH2 HILIC（Phenomenx, Torrance,CA）；流速：300μL/min；流動(dòng)相A：20mM氫氧化銨和20mM乙酸銨（pH=9.0）水溶液：乙腈（95:5），流動(dòng)相B：乙腈；洗脫梯度：0-5min：85-40%B；5-16min：40-0%B;16-24min，0%B；24-25min，0-85%B；25-32 min，85%B。

所有的統(tǒng)計(jì)計(jì)算使用CRAN軟件完成（http://www.r-project.org/）。只要是在某一個(gè)樣本中未檢測(cè)到的化合物都被舍棄，保證分析結(jié)果更可靠。這一步使得化合物數(shù)量從254個(gè)降低到124種。之后作者使用PCA分析、分層聚類、k均值聚類分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘，并利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)分析代謝通路。

惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤CSF特有的代謝特征：采用無(wú)監(jiān)督的分層聚類算法發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤病人CSF與對(duì)照組相比，其中代謝物水平有升高或降低（圖1A）。樹狀圖（圖1B）顯示的三個(gè)分支分別代表兩組膠質(zhì)瘤病人和一組正常樣本。

百趣代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，有意思的是，新診斷的膠質(zhì)瘤病人（1、2、5、7號(hào)）與其他樣本不在同一分支。圖1C顯示了區(qū)分膠質(zhì)瘤和正常樣本的各個(gè)代謝物做出的貢獻(xiàn)�？傊�，這種分層聚類算法不僅區(qū)分了膠質(zhì)瘤病人和對(duì)照組，而且還能夠區(qū)分新診斷的膠質(zhì)瘤病人和復(fù)發(fā)病人。這些信息是無(wú)法從MRI上獲得的。
 

圖1 CSF代謝物組成的分層聚類分析

作者也進(jìn)行了PCA分析，發(fā)現(xiàn)前3種主成分表現(xiàn)出顯著性差異（*，p=8.3×10-15; ** ,p=2.6×10-5; ***, p=1.8×10-9），分別占變異的28.1%、15.3%、13.9%（圖2A）。為了進(jìn)一步解釋這些成分，作者將前40個(gè)主成分導(dǎo)入KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，得到代謝物的通路分析結(jié)果。其中嘧啶代謝對(duì)2種主成分都做出了貢獻(xiàn)（圖2C）。代謝物來(lái)自三羧酸循環(huán)（n=5）、糖異生（n=4）、嘧啶代謝（n=4）為第一個(gè)主成分做出貢獻(xiàn)；代謝物來(lái)自尿素循環(huán)（n=4）、嘧啶代謝（n=4）為第2種主成分做出貢獻(xiàn)；代謝物來(lái)自蛋白質(zhì)生物合成（n=7）、尿素循環(huán)（n=4）、嘌呤代謝（n=4）為第3種主成分做出了貢獻(xiàn)。這些發(fā)現(xiàn)說(shuō)明體內(nèi)生化反應(yīng)可以區(qū)分膠質(zhì)瘤和正常樣本。

代謝物在前兩種主成分下的得分圖如圖2D，可以看出膠質(zhì)瘤病人聚成兩簇，并且與正常樣本相區(qū)分。百趣代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，采用k均值聚類分析，將不同化合物對(duì)各簇的貢獻(xiàn)標(biāo)示以不同的顏色，發(fā)現(xiàn)結(jié)果相同。說(shuō)明無(wú)論是分層聚類、PCA還是k均值聚類分析都可以獲得相同的結(jié)果，只是利用數(shù)據(jù)的不同方面。
 

圖2 CSF代謝物組成的PCA分析及k均值聚類分析

作者接下來(lái)分析了膠質(zhì)瘤與正常樣本存在差異的化合物，采用雙側(cè)t檢驗(yàn)分析，39個(gè)化合物存在顯著性差異（p<0.05）（圖3A，表2）。這些代謝物來(lái)源于多種代謝途徑，包括氨基酸、脂質(zhì)、嘧啶、中心碳原子代謝。百趣代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，膠質(zhì)瘤對(duì)代謝的改變直接來(lái)源于體細(xì)胞突變，比如MYC擴(kuò)增、PTEN缺失、蛋白質(zhì)丟失、EGFR擴(kuò)增、IDH1/IDH2突變。作者在3號(hào)病人腦脊液中檢測(cè)到高水平的2-羥戊二酸，說(shuō)明此病人可能是IDH1突變的膠質(zhì)瘤；腫瘤復(fù)發(fā)病人（3、10號(hào)）樣本中發(fā)現(xiàn)三羧酸循環(huán)中的代謝物顯著富集（圖3B），說(shuō)明這些化合物可以用來(lái)提示腫瘤復(fù)發(fā)的可能；新診斷的膠質(zhì)瘤病人中發(fā)現(xiàn)有7種代謝物與復(fù)發(fā)病人存在顯著性差異（p<0.05）（圖3C）。

其中有很多代謝物涉及組氨酸和色氨酸代謝，包括吲哚乙酸、吲哚、組氨酸、鄰氨基苯甲酸鹽。這條代謝途徑中的吲哚2,3加氧酶通常作為免疫功能的一個(gè)生物標(biāo)志物，故上述代謝物水平的變化可以反映這些病人的免疫功能變化。

表2膠質(zhì)瘤病人與對(duì)照組相比代謝物的變化情況

圖3惡性膠質(zhì)瘤類型的代謝物特征分析及與臨床指標(biāo)相關(guān)性分析
 

與臨床參數(shù)的相關(guān)性：臨床上采用兩個(gè)參數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)膠質(zhì)瘤病人的腫瘤大小，分別是Tgad和FLAIR。作者將以上兩種手段觀察到的腫瘤大小與檢測(cè)的代謝物關(guān)聯(lián)起來(lái)，發(fā)現(xiàn)有8個(gè)代謝物與Tgad相關(guān)，10個(gè)代謝物與FLAIR相關(guān)（R2>0.50）。百趣代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，并且有6個(gè)代謝物與Tgad和FLAIR均相關(guān)， 4個(gè)呈正相關(guān)，2個(gè)呈負(fù)相關(guān)；另一感興趣的指標(biāo)是生存期，作者發(fā)現(xiàn)有14個(gè)代謝物與生存期相關(guān)（R2>0.50）。（表3）其中3個(gè)代謝物（泛酸酯、生物素、氨基乙磺酸）可從食物中攝取故在CSF中能夠檢測(cè)到，其余代謝物為核苷酸和氨基酸代謝的中間產(chǎn)物。

CSF中肌醇水平降低，膽固醇硫酸酯水平升高與Tgad和FLAIR檢測(cè)到的腫瘤大小呈線性相關(guān)（圖3D）。肌醇是一個(gè)腦滲透性化合物，用磁共振光譜檢測(cè)，其在惡性膠質(zhì)瘤和細(xì)胞瘤中的水平比低級(jí)別膠質(zhì)瘤和正常腦組織中的水平低。該研究也顯示腫瘤大小與CSF中肌醇水平呈負(fù)相關(guān)；CSF中膽固醇硫酸酯水平與腫瘤大小正相關(guān)。膽固醇硫酸酯參與人支氣管上皮細(xì)胞鱗狀上皮生化過程，這也就暗示該代謝物來(lái)自正常組織的致癌性轉(zhuǎn)化。
 

表3與臨床指標(biāo)Tgad、FLAIR、生存期相關(guān)的代謝物

作者等人用惡性膠質(zhì)瘤的小組樣本，構(gòu)建了人腦脊液的整體代謝組學(xué)輪廓。研究發(fā)現(xiàn)，用少量樣本即可以顯著區(qū)分膠質(zhì)瘤病人與正常病人。開發(fā)了一種正負(fù)離子模式切換的LC-MS/MS方法用于代謝物檢測(cè)。采用無(wú)監(jiān)督的分類算法來(lái)尋找病人樣本間的總體差異，并研究與系統(tǒng)性癌癥相關(guān)代謝的生理學(xué)特點(diǎn)。百趣代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，盡管該研究中的樣本量較小，但某些代謝物水平的顯著差異暗示從腦脊液中發(fā)現(xiàn)代謝生物標(biāo)志物有很大潛力，代謝物特征同樣可以作為診斷標(biāo)志物。作者等人希望該研究可以擴(kuò)展代謝組學(xué)技術(shù)的適用性，并且促進(jìn)CSF中的代謝物分析為未來(lái)大樣本的腫瘤學(xué)臨床研究提供參考。

參考文獻(xiàn)：Jason W. Locasale, Tamar Melman, Susan Song,etal. Metabolomics of Human Cerebrospinal Fluid Identifies Signatures of Malignant Glioma. [J]. Mol. Cell. Proteomics 11, 2012, 1–12.