研究背景

       心肌細胞（CMs）是心臟的肌肉細胞，通過跳動產(chǎn)生機械張力來維持心臟功能。CMs的機械輸出來源于沿肌纖維排列的肌節(jié)的縮短。人iPS可以分化為跳動的CMs（hiPSC-CMs），但hiPSC-CMs中肌原纖維紊亂，不像原代CMs中那樣排列整齊，這種混亂一直是應(yīng)用hiPSC-CMs進行體外心功能分析的限制因素。基質(zhì)微圖案化培養(yǎng)hiPSC-CMs可以成功誘導(dǎo)胞內(nèi)肌原纖維對齊，從而增強收縮機制的成熟度，并可將這些工程細胞作為心臟收縮力的模型。在已知機械性能的柔性基質(zhì)上微圖案化培養(yǎng)hiPSC-CMs，通過無創(chuàng)和微創(chuàng)顯微法可計算機械輸出（圖1A）。此外通過明視野顯微鏡獲得的搏動細胞影像，也可跟蹤細胞運動，使用可變形微柱做基質(zhì)可測量細胞力。還有研究用構(gòu)建的包括hiPSC-CMs或與其他細胞共培養(yǎng)在內(nèi)的多細胞系統(tǒng)對機械輸出進行了研究。誘導(dǎo)胞內(nèi)肌原纖維排列是加速hiPSC-CMs收縮成熟的關(guān)鍵，而肌原纖維在單細胞系統(tǒng)中更容易成像，可實現(xiàn)活細胞分析。

       本文所述的平臺整合了不同成像類方法來分析微圖案化hiPSC-CMs的機械輸出，得到了表征細胞機械輸出的一系列參數(shù)。還利用該多重成像組合方法測量了肌節(jié)長度，量化了收縮缺陷細胞中收縮運動的不同步性。檢測了藥物對hiPSC-CMs和MYBPC3基因?qū)е率湛s缺陷的細胞的機械輸出的影響。證明該方法能夠分析藥理學(xué)條件下或心臟病模型中的心臟收縮情況。

測定原理

       在每一次搏動中，心肌細胞（CMs）通過收縮機制產(chǎn)生心臟功能所需的機械輸出，收縮機制包括肌節(jié)沿肌原纖維縮短。人誘導(dǎo)多能干細胞（hiPSCs）可分化為CMs（hiPSC-CMs），通過微圖案化形成生理形狀可作為模型，穩(wěn)定地模擬心臟收縮機械輸出。量化這些細胞的機械輸出可實現(xiàn)在培養(yǎng)皿中分析心臟活動。

測定參數(shù)

       研究使用了Plexithermo HCell系列單心肌細胞功能檢測系統(tǒng)。ZeissAxiovert 200M倒置顯微鏡，搭載Zeiss Axiocam MRm CCD相機獲取視頻，分析細胞收縮周期的機械輸出（圖1A）。獲得三類視頻：明場視頻、基質(zhì)中熒光微珠的視頻、熒光肌原纖維視頻，顯示了基質(zhì)、細胞表面和肌原纖維的運動。量化每幀移動結(jié)構(gòu)（細胞、微珠和肌原纖維）的平均位移（d）和移動速度（V）。使用牽引力顯微鏡通過基質(zhì)的位移估算收縮力，計算了由牽引應(yīng)力產(chǎn)生的力向量（F）的大小。F求和（ΣF），乘以V得到功率（P）。根基這些特征（d, V, ΣF, P）繪制的曲線確定參數(shù)，采用互相關(guān)算法Ncorr20以時間計算d和V（圖1B-F）。通過細胞邊界確定感興趣區(qū)域（ROI），根據(jù)ROI確定成比例的橢圓范圍，測量其中微珠的運動，得到其d曲線（圖1F）和V曲線（圖1G）。計算每幀的∑F，得到F曲線（圖1H）。利用時間繪制P（圖1I），量化肌原纖維運動（圖1J）來確定d曲線（圖1K）和V曲線（圖1L）。由d曲線得到細胞搏動率（br）。由d曲線和F曲線的峰值得到峰位移（dmax）和峰值力（ΣFmax）。通過V曲線確定收縮（VC）和舒張（VR）的峰值速度。通過P曲線確定收縮（PC）和舒張（PR）的峰值功率。時間參數(shù)（t­）表示收縮和舒張峰值間的時間（圖2A）。通過肌原纖維視頻量化sl。胞外添加咖啡因驗證以上參數(shù)的描述效果。證明圖像分析獲得的收縮和運動參數(shù)能夠可靠地描述細胞的機械輸出。

圖1 通過顯微鏡視頻獲得hiPSC-CMs的收縮機械輸出。（A）顯微鏡獲得的三種視頻。（B）根據(jù)細胞輪廓確定ROI，明場視頻互相關(guān)算法分析該區(qū)域運動。（C）收縮活動產(chǎn)生的細胞平均位移（d）。（D）細胞位移的平均速度（V）。（E）熒光視頻計算微珠的平均位移（d）。（F）微珠的d曲線與時間的函數(shù)。（G）微珠V曲線與時間的函數(shù)。（H）收縮力（ΣF）。（I）功率（P）。（J）肌原纖維中肌節(jié)占據(jù)的區(qū)域發(fā)生了骨骼化。（K）J中細胞肌原纖維的d曲線。（L）J中細胞的肌原纖維V曲線。

圖2 通過繪圖得到收縮周期參數(shù)。（A）通過V曲線確定代表每個收縮周期的3個動力學(xué)參數(shù)：VC為最大收縮速度，VR為最大舒張速度，t為兩峰值間的時間。（B）增加咖啡因濃度微珠d曲線的變化情況。（C）增加咖啡因濃度功率P的變化情況。

       通過異丙醇（ISO）和omecamtiv mecarbil (OM)誘導(dǎo)hiPSC-CMs機械輸出變化，利用以上參數(shù)描述細胞變化，驗證了參數(shù)可靠性，可用于量化不同濃度藥物引起的收縮變化（圖3，圖4）。

圖3 異丙腎上腺素（ISO）引起的機械輸出變化。（A）牽引力顯微鏡測定細胞產(chǎn)生的牽引應(yīng)力的熱圖。（D）熒光標記肌原纖維，成像以量化肌原纖維移動。根據(jù)ISO處理前后的微珠視頻獲得F曲線（B）和P曲線（C）。根據(jù)ISO處理前后的肌原纖維視頻獲得d曲線（E）和V曲線（F）。（G）明場視頻，獲得不同濃度ISO時的d曲線（H）和V曲線（I）。

圖4 檢測omecamtiv mecarbil (OM)引起的hiPSC-CM機械輸出變化。（A）添加OM前的肌原纖維。（B）添加后10s內(nèi)肌節(jié)急性收縮。（C）添加2min后肌節(jié)出現(xiàn)慢性損傷。通過微珠視頻獲得添加OM前及產(chǎn)生急慢性現(xiàn)過后的F曲線（D）和P曲線（E）。通過肌原纖維視頻獲得d曲線（F）和V曲線（G）。通過細胞明場視頻獲得d曲線（H）和V曲線（I）。

       此外通過肌節(jié)視頻還可量化ISO和OM引發(fā)的收縮周期中肌原纖維的肌節(jié)長度（sl）和縮短（ss）變化（圖5），以及分析收縮缺陷細胞中，胞內(nèi)運動的不同步性（圖6）。證明該多成像方法可靠且靈活多用。

圖5 ISO和OM引發(fā)的肌節(jié)長度（sl）和縮短（ss）變化。通過肌節(jié)視頻測量sl和ss。（A, E）平均sl的箱型圖。（B, F）sl最大值。（C, G）sl最小值。（D, H）sl最大值減去sl最小值得到ss。

圖6 編碼MYBPC3基因純合子和雜合子敲除的hiPSC-CMs中，空間（αθ）或時間（αδ）不同步性的測量參數(shù)。（A）每個像素位移峰的時間減去ROI平均位移的位移峰的時間，得到每個像素i的δ。（B）明場視頻中的ROI示意。（C）ROI中像素的δ的熱圖。（D-G）缺乏兩個拷貝（-/-）或缺乏一個拷貝（+/-）hiPSC-CMs中獲得的參數(shù)。（D）αθ。（E）αδ。（F）t。

研究結(jié)論

       本文的多成像方法不僅可表征單個hiPSC-CMs的心臟功能，還可確定闡明CM功能變化的機制的收縮參數(shù)。通過異丙腎上腺素實驗，驗證了該平臺可檢測不同藥物濃度下的收縮變化，通過OM實驗證明了檢測同一藥物急性和慢性影響的必要性。此外該方法侵入性小，且對數(shù)據(jù)獲取和分析能力要求低，拓寬了應(yīng)用范圍。總之，本文的多成像平臺量化了評估hiPSC-CMs收縮性能的關(guān)鍵參數(shù)�？紤]到肌節(jié)和收縮運動與力產(chǎn)生的關(guān)聯(lián)，該平臺為測量收縮表型提供了多種角度和方法。

參考文獻：
Ribeiro, A. J. , et al. "Multi-Imaging Method to Assay the Contractile Mechanical Output of Micropatterned Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes." Circulation Research (2017):1572-1583.