在基因治療領(lǐng)域，慢病毒載體(Lentivirus)是一種復(fù)制較慢的逆轉(zhuǎn)錄病毒，由HIV-1改造而來(lái)，常作為基因治療的載體使用。

    慢病毒載體的制備流程需要對(duì)病毒的物理滴度和感染滴度進(jìn)行檢測(cè)。

    1. 現(xiàn)有的檢測(cè)手段（如p24 ELISA）因病毒中p24蛋白的含量不同、含有p24蛋白的雜質(zhì)（如外泌體）等因素的影響，無(wú)法精準(zhǔn)地表征病毒的物理滴度，且此類方法均無(wú)法對(duì)空載病毒（無(wú)p24蛋白）進(jìn)行表征，這就給感染滴度的檢測(cè)帶來(lái)了誤差。

    2. 在復(fù)雜的病毒工業(yè)化制備流程中，只測(cè)量末端純化產(chǎn)品的滴度，無(wú)法真實(shí)反映各個(gè)生產(chǎn)環(huán)節(jié)的生產(chǎn)效率，而對(duì)各個(gè)生產(chǎn)環(huán)節(jié)的樣品都進(jìn)行純化表征會(huì)浪費(fèi)大量人力物力。目前研究者亟需一種無(wú)純化、快速、檢測(cè)下限低的病毒表征手段。

    3. 目前的病毒表征手段，均無(wú)法將病毒的物理參數(shù)如粒徑(與載體聚合相關(guān))與蛋白質(zhì)組分析聯(lián)系起來(lái)。因此，這些技術(shù)無(wú)法分析病毒滴度受樣品聚集或病毒破裂與分解影響的情況，因此無(wú)法區(qū)分單分散制劑與聚集樣品。
    對(duì)于上述問(wèn)題，美國(guó)NanoView公司所開(kāi)發(fā)的全自動(dòng)病毒熒光檢測(cè)分析系統(tǒng)是一款無(wú)需純化的、全自動(dòng)的可對(duì)病毒進(jìn)行表征分析的全新設(shè)備。該設(shè)備能夠提供全方位的病毒表征信息，包括病毒粒徑、病毒表面和內(nèi)部病毒蛋白、病毒物理滴度、空載比檢測(cè)、病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率及假型定量表征等。操作簡(jiǎn)單，結(jié)果可靠。

    全自動(dòng)病毒熒光檢測(cè)分析系統(tǒng)的基本原理是一種基于特異性免疫捕獲技術(shù)，允許研究者直接分析特定群體的病毒。通過(guò)配套的試劑盒，客戶一次性能夠分析多達(dá)16個(gè)不同的樣本，大大節(jié)省了時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本。

    和傳統(tǒng)的病毒表征手段相比，全自動(dòng)病毒熒光檢測(cè)分析系統(tǒng)有如下優(yōu)勢(shì)：

 

• 無(wú)需純化

    NanoView的LentiView™技術(shù)可以對(duì)慢病毒進(jìn)行檢測(cè)，將蛋白質(zhì)組信息與物理病毒滴度結(jié)合起來(lái)，無(wú)需樣品純化。只需 35 µl 未純化或純化的樣品，檢測(cè)濃度低至106VP/ml。無(wú)需擔(dān)心純化帶來(lái)的誤差，更精確地測(cè)量樣品間的表征和表達(dá)信息的差異。

慢病毒示意圖

• 全方位的病毒粒徑分析

全自動(dòng)外泌體熒光檢測(cè)分析系統(tǒng)能夠?qū)?gt;20 nm的病毒進(jìn)行全方面的表征，無(wú)論是粒徑分布、空載病毒與完整病毒的假型分析均可在一次測(cè)試中得到。并且所用來(lái)測(cè)試的樣本無(wú)需進(jìn)行純化，避免因純化帶來(lái)的樣本偏差。

• 病毒滴度

病毒物理滴度的最常用檢測(cè)方法是p24 ELISA。該方法測(cè)量p24衣殼蛋白的濃度并將其轉(zhuǎn)化為病毒物理滴度。樣品中溶解的p24、不同病毒p24含量的不同以及病毒聚集會(huì)影響檢測(cè)準(zhǔn)確性。此外， p24 ELISA無(wú)法檢測(cè)缺少衣殼(空載)的顆粒。LentiView™可對(duì)樣品中病毒進(jìn)行高靈敏度的定量檢測(cè)，獲得滴度數(shù)據(jù)，區(qū)分完整和空載病毒并識(shí)別樣品中雜質(zhì)如可能經(jīng)過(guò)純化帶有的外泌體等。

    紅色熒光抗體標(biāo)記病毒的內(nèi)部p24衣殼蛋白，用藍(lán)色熒光抗體標(biāo)記VSV-G，同時(shí)表達(dá)p24和VSV-G的病毒顯示粉紅色，并由 NanoView專用軟件計(jì)數(shù)。

• 完整/空載病毒顆粒的比例

    NanoView的LentiView™技術(shù)可以簡(jiǎn)單快速地分析出完整/空載病毒顆粒的比例，區(qū)分完整(成功轉(zhuǎn)導(dǎo))和空載病毒并識(shí)別樣品中雜質(zhì)，而完整/空載病毒顆粒的比例是確定轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的主要依據(jù)。

 

 

    完整病毒是表達(dá)VSV-G和/或ETL，且表達(dá)衣殼蛋白p24的病毒顆粒，空載病毒是表達(dá)VSV-G和/或ETL，未表達(dá)衣殼蛋白p24的病毒顆粒

    LentiView™芯片表面固定的抗VSV-G抗體捕獲病毒后，即可檢測(cè)表面和內(nèi)部蛋白標(biāo)記物。在LentiView™獲得熒光圖像中，綠色熒光點(diǎn)代表沒(méi)有衣殼的VSV-G+病毒顆粒，黃色熒光點(diǎn)代表含有衣殼的完整病毒顆粒。

• 病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率

    我們使用LentiView™對(duì)三種不同的慢病毒樣品進(jìn)行了表征，檢測(cè)病毒顆粒亞群，進(jìn)而研究這些載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。三種不同的慢病毒樣品分別為野生型慢病毒 (VSV wt)、含高濃度質(zhì)粒的工程化靶向配體 (ETL-HC)、含低濃度質(zhì)粒的工程化靶向配體 (ETL-LC)。

三種慢病毒載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率

轉(zhuǎn)導(dǎo)效率與物理滴度的對(duì)比

    根據(jù)病毒碎片粒徑和病毒粒徑的差別，對(duì)每一種載體中的病毒和病毒碎片數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。50nm以上的病毒與50nm以下的病毒碎片的比例和載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性。

載體轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和病毒與病毒碎片比例的對(duì)比

• 完全定制化

    客戶通過(guò)ViroFlex技術(shù)使用連接蛋白連接任意定制化的捕獲抗體，并結(jié)合到ViroFlex芯片表面進(jìn)而捕獲所需的病毒，在自己的實(shí)驗(yàn)室里輕松進(jìn)行高度定制化的檢測(cè)。

ViroFlex的芯片捕獲抗體排布示意圖

ViroFlex定制化檢測(cè)原理：

• 先將連接蛋白與所需的定制抗體連接

• 再將連接抗體的連接蛋白與ViroFlex芯片表面的連接蛋白抗體連接

• 所需的定制抗體從而結(jié)合到了芯片上

• 將樣品在芯片上孵育，定制抗體即可特異性捕獲病毒

• 每個(gè)芯片最多可結(jié)合兩種定制化捕獲抗體

ViroFlex芯片的捕獲原理(左)與普通芯片的捕獲原理(右)示意圖

ExoViewTM參數(shù)信息：

• 顆粒大小分辨范圍：20nm

• 最低檢測(cè)濃度為106 VP/mL

• 所需樣本體積：35 μL

• 激發(fā)波長(zhǎng)：410 nm，488 nm，555 nm，640 nm，750nm

• 可一次檢測(cè)16個(gè)樣本，每個(gè)樣本可同時(shí)檢測(cè)6個(gè)不同亞型及4種生物標(biāo)記的熒光定位

• 捕獲抗體：一個(gè)芯片最多允許6種捕獲抗體（+陰性對(duì)照）

• 熒光通道：4個(gè)熒光通道

相關(guān)產(chǎn)品
1、全自動(dòng)外泌體熒光檢測(cè)分析系統(tǒng)
http://www.kmsnd.com/show1equip.asp?equipid=574686
2、ExoView外泌體全面表征試劑盒
http://www.kmsnd.com/show1equip.asp?equipid=4839430