北京冬奧會運動員們都完美詮釋了奧運精神。在生物工藝開發(fā)中，純化層析介質(zhì)POROS 也有著更高（載量），更快（流速），更強（覆蓋）的奧運精神哦。

親和介質(zhì)實現(xiàn)特定的捕獲

在抗體類生物藥的下游工藝中，親和層析是一個流行的first-line純化步驟。利用配體和目標分子之間的相互作用。理想的配體-靶標相互作用是特異性強的，因此只有靶標分子結(jié)合而非靶標分子不結(jié)合。親和層析法是有效的。有時一步就能達到高純度。在某些情況下，親和樹脂已經(jīng)很好地建立了特定的biotherapeutic。例如，單克隆抗體的純化依賴于一種蛋白A的特異性親和配基。然而，許多生物治療分子缺乏成熟的親和純化工藝或市場上可獲得的親和介質(zhì)。

圖1:CaptureSelect親和配體來自于駱駝免疫球蛋白(Ig)抗體，該抗體已被削減到n端結(jié)構(gòu)域(VHH片段)，包括可變抗原結(jié)合區(qū)域，也稱為互補決定區(qū)域(CDR)，(綠色、藍色和紅色顯示)。親和配體的抗原結(jié)合區(qū)域可以被調(diào)整以特異性地識別和捕獲目標分子，包括已知的蛋白質(zhì)標簽和未標記的蛋白質(zhì)。

可調(diào)節(jié)的親和配體，例如Thermo Fisher Scientific的CaptureSelectTM親和層析技術(shù)中使用的配體，可以擴展生物療法的純化選擇。這些配基來自于在駱駝體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種僅重鏈抗體的可變抗原結(jié)合區(qū)。典型的抗體由兩條重鏈和兩條輕鏈組成，形成二聚體;駱駝羚抗體缺乏這種輕鏈，但保留了特異性和強效結(jié)合抗原的能力。研究人員對駱駝抗體進行了生物工程改造，使其只包含可變的抗原結(jié)合區(qū)域，稱為VHH片段(圖1)。VHH片段的可變抗原結(jié)合區(qū)域可以被修改，以“調(diào)整”配體，使其幾乎可以針對任何抗體、蛋白質(zhì)或病毒載體。

用于純化抗體的 CaptureSelectTM親和層析選擇

基因治療領(lǐng)域用于純化AAV病毒載體的親和層析介質(zhì)

用于純化mRNA分子的親和層析介質(zhì) ：POROS™ Oligo (dT)25

但在某些情況下，親和力捕獲可能不是目標分子的選擇。即使是可以通過親和步驟捕獲的分子，通常也需要額外的純化步驟，以確保所有非目標分子被去除。這些后續(xù)的層析精純步驟大多基于非親和層析介質(zhì)，如離子交換或疏水相互作用色譜。
 

介質(zhì)硬度和孔隙率的考慮

介質(zhì)beads的大小、孔隙度和結(jié)構(gòu)因素各不相同，這些因素會影響純化過程的速度和效率。來自Thermo Fisher Scientific的POROS™層析介質(zhì)具有幾個物理特性，使其能夠有效地分離混合物中的分子。

圖2:掃描電子顯微鏡圖像顯示左側(cè)的POROS beads，右側(cè)的放大圖像顯示大的通孔。這些beads具有增加的表面積，因此在保持將目標分子從雜質(zhì)中分離出來的能力同時，具有更大的結(jié)合能力。

POROS beads的尺寸較小為50 μm，但孔徑較大。小尺寸和beads內(nèi)孔隙率有效地增加了目標分子和介質(zhì)之間的相互作用表面積，并能夠更好的分離(圖2)，POROS介質(zhì)降低了傳質(zhì)阻力，意味著分子更容易進出beads。工藝開發(fā)人員用較少的緩沖溶液體系來純化目標物，從而增加載量以及高度濃縮純化后的目標物。
 

影響介質(zhì)選擇的另一個因素是:介質(zhì)的清洗和洗脫步驟中的條件，如pH值、鹽的類型和濃度。它們將影響生物療法結(jié)合或從介質(zhì)中洗脫的效果，以及非目標分子被洗掉的效果。介質(zhì)應(yīng)能在各種條件下保持其物理化學性質(zhì)。它們在使用后還需要清洗，以防止樣品的交叉污染和控制細菌生長的風險;這一過程通常涉及到刺激性的化學物質(zhì)。POROS 基架是由使介質(zhì)在各種條件下更穩(wěn)定的材料制成的。
 

硬質(zhì)介質(zhì)的另一個好處是，產(chǎn)業(yè)化放大更容易操作�？梢栽诓伙@著影響結(jié)合能力的情況下增加流速，這意味著可以在更高流速下進行純化，減少處理時間，從而提高生產(chǎn)率。一般來說，硬質(zhì)介質(zhì)能夠承受高反壓和高流速，高反壓會導(dǎo)致純化失效并堵塞設(shè)備，通常情況你不想要容易破裂的介質(zhì)。而有能力處理機械應(yīng)力和高流速，后者對于工業(yè)規(guī)模的過程尤其重要，因為這涉及到更大的色譜柱和樣品體積。
 

除了它們的物理性質(zhì)，介質(zhì)可以被修飾用于離子交換或疏水相互作用層析，這兩種方法都可以幫助純化生物藥物。

離子交換層析介質(zhì)

離子交換色譜法根據(jù)目標分子和介質(zhì)之間的電荷相互作用來分離。有兩種基本類型: 陰離子交換，用帶正電的介質(zhì)與帶負電的目標分子結(jié)合; 陽離子交換，用帶負電的介質(zhì)與帶正電的目標分子結(jié)合。非目標分子也可以根據(jù)其電荷被捕獲，并允許目標分子通過介質(zhì)不受阻礙地收集。通過提供不同的電荷選擇性，離子交換介質(zhì)可以為目標分子純化提供量身定制的解決方案。
 

POROS陽離子和陰離子交換介質(zhì)通過最大限度地提高產(chǎn)品產(chǎn)量和去除非目標分子，幫助改善生物藥的大規(guī)模純化生產(chǎn)。例如，陽離子交換層析是Avastin®工業(yè)純化的一個組成部分，（Avastin®是一種用于治療膠質(zhì)母細胞瘤、黃斑變性和其他疾病的單克隆抗體）。為了提高生產(chǎn)工藝的純度和收率，Avastin的制造商探索了將POROS陽離子交換介質(zhì)納入生產(chǎn)流程的方法，與之前使用的介質(zhì)相比，改用POROS HS 50提高了11%的收率。此外，與之前的方法相比，POROS陽離子交換介質(zhì)從產(chǎn)品中去除了更多的污染病毒。
 

另一個案例是正在尋找一種介質(zhì)，可以去除親和層析步驟后殘留的雜質(zhì)。就目前的情況來看，他們的陰離子交換步驟需要低流速來實現(xiàn)產(chǎn)物分離。這意味著樣品和緩沖液通過純化柱需要更多的時間，導(dǎo)致純化柱大，純化時間長。該公司的工藝開發(fā)人員對Thermo Fisher Scientific公司的陰離子交換樹脂POROS HQ進行了評估，并對其進行了優(yōu)化，使其成為一直使用的填料產(chǎn)品選擇。他們能夠?qū)⒅�流速提�?倍以上，并將處理時間縮短10倍。該公司還能夠裝載超過兩倍的樣品到柱上，并獲得了與之前方法相比較的收益率。最后，POROS HQ幫助去除大部分雜質(zhì)和病毒，如異嗜性小鼠白血病病毒，這是一種可以感染哺乳動物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的常見病毒。
 

疏水相互作用層析介質(zhì)

疏水相互作用層析(HIC)介質(zhì)的工作原理是，柱上的疏水配體可以與目標分子的疏水表面基團結(jié)合。疏水性介質(zhì)在相互作用中可以從弱到強，這取決于對目標分子的選擇性。HIC介質(zhì)在試圖從密切相關(guān)的分子中分離生物藥物分子時特別有效果，包括自聚集，即目標分子粘在自己身上并形成一團分子。自聚集會降低生物藥物的安全性或有效性。它們通常具有不同于單體生物藥的物理化學性質(zhì)，這可以利用疏水層析技術(shù)，特別是用于去除自聚集物。
 

工藝開發(fā)人員與Thermo Fisher Scientific合作，幫助其改進已建立的治療性單克隆抗體的純化過程，具體目標是最大限度地去除聚集物。原始工藝中HIC層析沒有被包括在純化方案中，因為高效的疏水分離需要高鹽濃度的緩沖液，這會破壞目標抗體的穩(wěn)定性。該工藝的開發(fā)人員使用了強疏水性層析介質(zhì)POROS Benzyl Ultra，它允許在非常低的鹽條件下使用。為了優(yōu)化生產(chǎn)效率，介質(zhì)被操作在流穿模式。這意味著含有目標分子的溶液流穿柱子，而具有更多總疏水表面積的聚集體被結(jié)合到柱上，從而從最終產(chǎn)品中除去。最后，使用強疏水性介質(zhì)，精純步驟成功，聚體去除效率高，單體接近完全回收，最終產(chǎn)品收率提高8%。并且純化效率提高4倍。
 

通過在工藝開發(fā)工具箱中擁有各種介質(zhì)選項，開發(fā)人員可以為正在開發(fā)的各種生物藥分子定制他們的純化工藝。隨著對新型生物療法的需求不斷上升，高效和可規(guī)�；�的純化策略將是滿足臨床需求的關(guān)鍵，無論是現(xiàn)在還是未來。