相比于2D細(xì)胞模型，類器官能夠更真實(shí)地反映和模擬體內(nèi)真實(shí)的生理和病理環(huán)境。發(fā)展至今，類器官在精準(zhǔn)醫(yī)療、藥物發(fā)現(xiàn)、再生醫(yī)學(xué)及疾病建模等多個(gè)研究領(lǐng)域表現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力。盡管很多應(yīng)用還處于早期開發(fā)階段，但類器官為疾病研究提供新的機(jī)會(huì)，并為現(xiàn)有的細(xì)胞系和動(dòng)物模型提供重要補(bǔ)充。  
 
類器官培養(yǎng)與分析的痛點(diǎn)
包括美國(guó)菌種保藏中心（ATCC）在內(nèi)的多個(gè)組織和研究機(jī)構(gòu)發(fā)布許多針對(duì)多種類器官培養(yǎng)的protocol，定義了其培養(yǎng)條件、接種密度、基質(zhì)建議和其他關(guān)鍵參數(shù)。但是對(duì)類器官的定量分析面臨重重挑戰(zhàn)：
 

• 每個(gè)孔中類器官形成的重復(fù)性無(wú)法保證，缺少成熟的實(shí)驗(yàn)方案
• 檢測(cè)和數(shù)據(jù)通量低
• 費(fèi)時(shí)耗力，需要手動(dòng)操作獲取類器官圖像
• 需要借助第三方軟件做分析——定量信息有限
• 圖像采集過程中的環(huán)境控制不到位，導(dǎo)致結(jié)果可信度不高

 
賽多利斯Incucyte®實(shí)時(shí)活細(xì)胞分析系統(tǒng)可謂應(yīng)時(shí)而生。
 

• 專有的明場(chǎng)（BF）圖像采集能夠可視化、定量化地監(jiān)測(cè)類器官在Matrigel® domes中形成和生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)；
• 通過自動(dòng)繪制類器官尺寸、計(jì)數(shù)和形態(tài)隨時(shí)間變化的圖譜，提供關(guān)于分化和成熟的定量數(shù)據(jù)；
• 置于培養(yǎng)箱中直接進(jìn)行分析，避免類器官所需生理環(huán)境被干擾。

   
 
三個(gè)步驟
“一加、二拍、三分析”


 
Incucyte® 分析Matrigel® domes培養(yǎng)類器官的實(shí)驗(yàn)流程。能夠輕松培養(yǎng)、擴(kuò)增和維護(hù)類器官培養(yǎng)物，反映相應(yīng)器官的生理學(xué)。
 
 
四大應(yīng)用
 
1. 類器官生長(zhǎng)
2. 類器官培養(yǎng)條件
3. 類器官成熟階段
4. 類器官分化及生長(zhǎng)效率
 
Incucyte®類器官分析簡(jiǎn)單實(shí)用，一學(xué)就會(huì)！


應(yīng)用1：監(jiān)測(cè)并量化類器官生長(zhǎng)

應(yīng)用亮點(diǎn)：Incucyte®能夠在長(zhǎng)達(dá)數(shù)天、數(shù)周甚至數(shù)月的時(shí)間內(nèi)，對(duì)多種組織樣本進(jìn)行定量分析。檢測(cè)過程發(fā)生在穩(wěn)定的培養(yǎng)箱環(huán)境中，避免來(lái)回取放培養(yǎng)板對(duì)類器官生長(zhǎng)造成的影響。

使用Incucyte®及類器官分析軟件對(duì)生長(zhǎng)于Matrigel® dome培養(yǎng)的三種不同類器官的生長(zhǎng)情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)（圖1，左：腸道類器官；中：胰腺類器官；右：肝臟類器官）。頂行顯示了接種后6天后三種不同類型類器官的單一對(duì)焦BF二維圖像；中間行為頂行方框內(nèi)放大后的圖像，顯示了細(xì)胞類型的具體形態(tài)特征。底行顯示了單個(gè)孔中BF區(qū)域面積（μm2）隨時(shí)間的變化，證明了特定細(xì)胞類型的類器官生長(zhǎng)。成熟的肝臟和胰腺類器官表現(xiàn)出相似的大小和快速生長(zhǎng)能力，而腸道類器官則顯得較小，并在成熟時(shí)表現(xiàn)出明顯的發(fā)芽形態(tài)。 圖1. 在Matrigel® Dome中捕獲和量化三種不同類器官的生長(zhǎng)。將小鼠腸道（1:3傳代，50% Matrigel®）、胰腺（1:5傳代，100% Matrigel®）和肝臟類器官（1:40傳代，100% Matrigel®）嵌入24孔板的Matrigel® Dome中，并在Incucyte®系統(tǒng)中每6小時(shí)用4倍鏡采集一次圖像。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表均值±SEM，n=4個(gè)孔。
 
 
應(yīng)用2：優(yōu)化類器官培養(yǎng)條件

應(yīng)用亮點(diǎn)：Incucyte®能夠?qū)崟r(shí)、連續(xù)地監(jiān)測(cè)類器官形成的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，捕捉細(xì)胞形態(tài)變化，從而客觀地評(píng)估生長(zhǎng)條件和接種密度的影響，并確定最大化擴(kuò)增所需的條件。

使用Incucyte®篩選小鼠肝臟類器官的最佳培養(yǎng)條件。首先將小鼠肝臟類器官以多種密度接種到Matrigel® Dome中，通過Incucyte®軟件自動(dòng)對(duì)其尺寸和計(jì)數(shù)進(jìn)行分析。接種5天后獲取的BF圖像和時(shí)間曲線（圖2）。結(jié)果顯示類器官大小和生長(zhǎng)率與細(xì)胞數(shù)量成正比。以最高密度接種的類器官較大（直徑>500 μm），并表現(xiàn)出快速生長(zhǎng)的特點(diǎn)，在120小時(shí)達(dá)到最大尺寸。而在較低的密度下，類器官的成熟階段延長(zhǎng)，且具有最大的生長(zhǎng)潛力（平均面積時(shí)程曲線）。 圖2. 確定類器官擴(kuò)增的最優(yōu)條件將小鼠肝臟器官嵌入Matrigel® Dome（100%），在48孔板中以多種密度接種。接種后五天獲取BF圖像。每隔6小時(shí)收集數(shù)據(jù)，總計(jì)168小時(shí)。4倍鏡拍攝所有圖像。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表均值±SEM，n=14個(gè)孔。
 
 
應(yīng)用3：鑒定類器官最佳成熟階段

應(yīng)用亮點(diǎn)：Incucyte® 能夠?qū)崟r(shí)、定量分析類器官偏心率、暗度等細(xì)胞形態(tài)的變化，快速、精確地評(píng)估最佳培養(yǎng)傳代周期，為下游實(shí)驗(yàn)打好基礎(chǔ)。

為了確定嵌入Matrigel® Dome中的小鼠肝臟類器官的最佳傳代頻率，使用Incucyte®對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行了8天的圖像采集（圖3）。通常情況下，肝臟類器官在達(dá)到最大生長(zhǎng)限并且沒有萎陷時(shí)就可以進(jìn)行傳代。BF圖像顯示，接種兩天后，大多數(shù)類器官的直徑小于100 μm，并且有清晰的腔隙，不適合傳代。隨后48小時(shí)內(nèi)觀察到偏心率的下降（見最右側(cè)時(shí)間曲線），類器官接近圓形。該培養(yǎng)物傳代的最佳時(shí)期發(fā)生在第4天和第5天之間，此時(shí)Dome內(nèi)的大多數(shù)類器官已達(dá)到最大尺寸，呈圓形且沒有萎陷。第6天的圖像和時(shí)間曲線表明，達(dá)到最大尺寸的類器官已經(jīng)萎陷且變暗。


圖3：使用綜合形態(tài)定義特定細(xì)胞類型的傳代頻率。將肝臟類器官嵌入24孔板中的100% Matrigel® Dome（1:10傳代）。每隔6小時(shí)收集數(shù)據(jù)，總計(jì)192小時(shí)。4倍鏡拍攝所有圖像。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表均值±SEM，n=6個(gè)孔。
 
 
應(yīng)用4：實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)類器官分化及生長(zhǎng)效率

應(yīng)用亮點(diǎn)：Incucyte®長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)成像和分析的能力能夠?qū)︻惼鞴贁U(kuò)增提供可靠、可重復(fù)的評(píng)估。通過類器官軟件能夠動(dòng)態(tài)、客觀地量化多個(gè)參數(shù)，更高效且簡(jiǎn)便地評(píng)估延長(zhǎng)傳代期時(shí)類器官的擴(kuò)增和生長(zhǎng)效率。

在此案例中，當(dāng)傳代密度保持一致時(shí)，隨著時(shí)間的推移，腸道類器官表現(xiàn)出重復(fù)性較高的計(jì)數(shù)、面積、偏心率和暗度值。此外，接種后第7天的BF圖像證實(shí)了對(duì)明確出芽表型的維持狀態(tài)。 圖4. 評(píng)估多次傳代的類器官生長(zhǎng)和分化效率。將腸道類器官嵌入50%的Matrigel® Dome（1:3傳代，24孔板），經(jīng)過多次傳代，確定其隨著時(shí)間推移的生長(zhǎng)和分化一致性。每隔6小時(shí)收集數(shù)據(jù)，總計(jì)192小時(shí)。4倍鏡拍攝所有圖像。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表均值±SEM，n=6個(gè)孔。
 
 
Summary
Incucyte® 實(shí)時(shí)活細(xì)胞分析系統(tǒng)，結(jié)合Incucyte®類器官分析軟件可促進(jìn)對(duì)類器官形成和生長(zhǎng)過程動(dòng)態(tài)、定性、準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)，使類器官培養(yǎng)與分析不再困難。
 
 
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賽多利斯電子書《類器官與藥物發(fā)現(xiàn)》，匯總了3D類器官模型在腫瘤學(xué)、新藥發(fā)現(xiàn)、轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)等研究的學(xué)習(xí)資源，總結(jié)并介紹了實(shí)時(shí)活細(xì)胞分析技術(shù)在3D細(xì)胞及類器官培養(yǎng)研究中的實(shí)驗(yàn)操作及應(yīng)用案例。
-參考文獻(xiàn)-
Sato T, Vries RG, Snippert HJ, van de Wetering M, Barker N, Stange DE, van Es JH, Abo A, Kujala P, Peters PJ, Clevers H. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature 459: 262–265, 2009.