外泌體內(nèi)容物包含蛋白質(zhì)、RNA、DNA和脂類，可以被設(shè)計(jì)用于藥物傳遞系統(tǒng)與疾病的新型診斷標(biāo)志物，具有重要的研究意義。但傳統(tǒng)的技術(shù)方法如Western Blot，ELISA，無法獲得單個外泌體的蛋白表型，更不能將檢測內(nèi)容物與粒徑分析、濃度分析、計(jì)數(shù)等聯(lián)系起來，極大地制約了外泌體內(nèi)容物的相關(guān)研究。

單外泌體表征分析（Exoview）是將免疫學(xué)與光學(xué)結(jié)合的一種新技術(shù)^[1]。首先利用免疫識別將特定的外泌體進(jìn)行捕獲分離，然后再對目標(biāo)外泌體的表面標(biāo)志物及內(nèi)容物（如攜帶的蛋白質(zhì)、RNA、DNA及細(xì)胞因子）進(jìn)行定量分析，從而更加全面地反映外泌體內(nèi)容物的特性。相對于傳統(tǒng)的手段主要優(yōu)勢有：

☛ 無論是尿液、血清、血漿、組織液、細(xì)胞液均無需純化，即可檢測；

☛ 檢測靈敏度高，單外泌體水平探測；

☛ 一次性輸出指標(biāo)豐富，單次檢測即可輸出外泌體的：粒徑、技術(shù)、表面標(biāo)志物（CD9/CD63/CD81）、熒光表達(dá)及亞群分布；

本文選取了部分單外泌體表型分析技術(shù)在內(nèi)容物方向的zui新進(jìn)展，供大家參考。

J   Extracell Vesicles：單外泌體水平的蛋白內(nèi)容物檢測與定量

外泌體的內(nèi)容物可以通過生物工程手段修飾。其中，將選擇的蛋白內(nèi)容物與外泌體的EV-sorting proteins通過細(xì)胞工程融合是最常用的方法。這種方法既可以在腔內(nèi)儲存可輸送到靶細(xì)胞的內(nèi)容物，也可以讓內(nèi)容物與靶細(xì)胞表面受體結(jié)合來增強(qiáng)它們的治療信號特性或靶向能力。因此，Silva等^[2]在單外泌體水平上，通過分析工程化外泌體技術(shù)對不同外泌體的EV-sorting proteins在促進(jìn)蛋白內(nèi)容物的裝載效率進(jìn)行了評估。

研究人員分別將含有7種EV-sorting proteins（GFP偶聯(lián)）的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染Expi293F細(xì)胞，分離純化了細(xì)胞分泌的外泌體后檢測外泌體的表型并進(jìn)行蛋白定量。ExoView芯片上包被的CD63/CD81/CD9抗體捕獲外泌體后，使用帶紅色熒光的CD63/CD81/CD9熒光抗體標(biāo)記所有外泌體，帶綠色熒光的GFP熒光抗體標(biāo)記表達(dá)GFP的外泌體（圖1a）。圖1b是外泌體的熒光掃描圖像，可以確認(rèn)每個熒光標(biāo)記了GFP外泌體同時也被CD63/CD81/CD9標(biāo)記，由此可以計(jì)算出含目標(biāo)蛋白外泌體占總數(shù)的比例（圖1c）。ExoView還可以檢測單個外泌體的熒光強(qiáng)度，進(jìn)而得到樣品熒光強(qiáng)度的均值（圖1d），可以表示GFP的相對含量。以上結(jié)果表示，CD63，TSPAN14和CD81TM能夠使目的蛋白內(nèi)容物高效地裝載外泌體。

圖1. ExoView檢測外泌體表型與相對含量

Lab   on a Chip：細(xì)胞外囊泡介導(dǎo)的母胎之間HMGB1信號誘導(dǎo)早產(chǎn)

早產(chǎn)（PTB，小于37周的妊娠）每年影響了全球約11％的孕婦，造成100萬新生兒的死亡。高遷移率族蛋白B1（HMGB1）是一種警報(bào)素，是衰老羊膜細(xì)胞通過細(xì)胞外囊泡釋放的炎癥信號之一。羊水、臍帶血和孕婦血液中的HMGB1水平升高與足月和早產(chǎn)有關(guān)。Enkhtuya Radnaa等[3]通過電穿孔把正常羊膜上皮細(xì)胞的外泌體改造為裝載HMGB1的外泌體（eHMGB1）并對其進(jìn)行表征。結(jié)果顯示導(dǎo)致PTB的裝載HMGB1的外泌體（eHMGB1）與增加的母-胎界面（FMi）炎癥有關(guān)。該研究證明了胎兒外泌體介導(dǎo)的旁分泌信號傳導(dǎo)可以產(chǎn)生炎癥并誘導(dǎo)分娩。

其中，研究人員使用單個外泌體表型分析技術(shù)( ExoView )檢測了電穿孔法向外泌體載入HMGB1的效率。ExoView的芯片上包含了CD63/CD81/CD9抗體，分別捕獲了未裝載（eCTRL）和裝載HMGB1的外泌體（eHMGB1），使用試劑盒自帶的穿膜試劑對外泌體進(jìn)行處理后，再使用熒光抗體分別標(biāo)記HMGB1/CD63/CD9，進(jìn)行粒徑檢測和表型分析。

圖2粒徑檢測結(jié)果顯示，eCTRL和裝載HMGB1的外泌體（eHMGB1）的粒徑分布沒有顯著差異，表示電穿孔處理沒有改變外泌體的粒徑。
 

圖2. ExoView檢測未裝載（eCTRL）和裝載HMGB1的外泌體（eHMGB1）的粒徑分布

圖3熒光計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，裝載HMGB1的外泌體（eHMGB1）中HMGB1陽性外泌體數(shù)量明顯高于eCTRL，而CD9和CD63陽性的外泌體在兩個樣本中數(shù)量接近，這表明HMGB1已成功裝載到eHMGB1中（圖3）。

圖3   ExoView檢測未裝載（eCTRL）和裝載HMGB1的外泌體（eHMGB1）的表型

在以上的研究中，ExoView系統(tǒng)能夠以極高的靈敏度和特異性精準(zhǔn)地檢測到外泌體的內(nèi)容物，同時對外泌體的表型進(jìn)行準(zhǔn)確全面的表征。外泌體內(nèi)容物的研究、編輯和外源分子導(dǎo)入，是當(dāng)今外泌體研究的重點(diǎn)，在臨床診斷和生物治療方面具有巨大的潛力。

作為外泌體表征分析的倡導(dǎo)者，美國NanoView Biosciences于2018年推出了全自動外泌體熒光檢測分析系統(tǒng)ExoView，該系統(tǒng)一經(jīng)推出，便引起了外泌體領(lǐng)域科研工作者的廣泛關(guān)注，憑借其穩(wěn)定、出色的性能，短短幾年在全球已有近百個客戶，發(fā)表文獻(xiàn)100多篇。ExoView的精準(zhǔn)表征，能夠幫助科學(xué)家更深入地了解外泌體與疾病之間的關(guān)系，助力疾病診斷和新藥開發(fā)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Radnaa, E., Richardson, L. S.,   Sheller-Miller, S., Baljinnyam, T., de Castro Silva, M., Kammala, A. K., ...   & Menon, R. (2021). Extracellular vesicle mediated feto-maternal HMGB1   signaling induces preterm birth. Lab on a Chip, 21(10), 1956-1973.

[2] Silva, A. M., Lázaro‐Ibáñez, E.,   Gunnarsson, A., Dhande, A., Daaboul, G., Peacock, B., ... & Dekker, N.   (2021). Quantification of protein cargo loading into engineered extracellular   vesicles at single‐vesicle and single‐molecule resolution. Journal of   Extracellular Vesicles, 10(10), e12130.

全自動外泌體熒光檢測分析系統(tǒng)（ExoView R100）簡介

Nanoview所開發(fā)的全自動外泌體熒光檢測分析系統(tǒng)（ExoView R100）采用單粒子干涉反射成像傳感器（SP-IRIS）技術(shù)，是一款無需純化的全自動的新型外泌體表征設(shè)備。該設(shè)備能夠提供全方位的外泌體表征信息，包括顆粒大小、計(jì)數(shù)、表型與生物標(biāo)志物共定位等，提供多層次和全面的外泌體測量解決方案。
 

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