01  要點(diǎn)概括

1.對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)、長(zhǎng)期、無標(biāo)記的活細(xì)胞成像，了解它們對(duì)不同治療的反應(yīng)以及它們與免疫細(xì)胞的相互作用，對(duì)于理解藥物治療效果、免疫反應(yīng)過程以及導(dǎo)致疾病進(jìn)展的因素等至關(guān)重要。
 

2. Nanolive的無標(biāo)記成像方法允許研究人員以高時(shí)空分辨率、不受干擾、無光毒性的方式監(jiān)測(cè)巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和T細(xì)胞對(duì)癌細(xì)胞的協(xié)同反應(yīng)
 

3. Nanolive技術(shù)使得免疫細(xì)胞和癌細(xì)胞相互作用過程中發(fā)生的細(xì)胞形態(tài)和行為包括入侵、遷移和轉(zhuǎn)移到細(xì)胞死亡的疾病過程的各個(gè)階段的變化變得可視化。還可以對(duì)細(xì)胞增殖進(jìn)行定量分析，使研究人員能夠比較癌細(xì)胞對(duì)不同抗體或免疫檢查點(diǎn)抑制劑的反應(yīng)。

4. Nanolive技術(shù)無標(biāo)記，無光毒性，使連續(xù)監(jiān)測(cè)活細(xì)胞成為可能。因此，它是跟蹤細(xì)胞共培養(yǎng)中發(fā)生的動(dòng)態(tài)互動(dòng)的理想選擇。
 

02  腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞互作3D無標(biāo)記成像

本應(yīng)用有六個(gè)案例：檢查T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞之間的相互作用（案例1）；Nanolive用于T細(xì)胞對(duì)癌細(xì)胞的反應(yīng)（案例2）以及T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞之間發(fā)生的相互作用（案例3）進(jìn)行成像；Nanolive活細(xì)胞成像用于監(jiān)測(cè)癌細(xì)胞對(duì)有前景的抗體-藥物結(jié)合物（ADC）產(chǎn)品（案例4）和新型雙特異性抗體（案例5和6）。
 

案例一：細(xì)胞參與天性和適應(yīng)性免疫

背景

Nanolive技術(shù)無標(biāo)記，無光毒性，使連續(xù)監(jiān)測(cè)活細(xì)胞成為可能，非常適合高時(shí)空分辨率跟蹤在共培養(yǎng)中發(fā)生的相互作用，以及先天性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中不同細(xì)胞類型之間的動(dòng)態(tài)互作，且不受基于熒光的成像或終點(diǎn)分析的限制。
 

試驗(yàn)方法：

從骨髓中分離提前刺激來自C57BL/6小鼠的抗原呈遞樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞并進(jìn)行體外分化。然后將它們與來自O(shè)T-I小鼠的新鮮分離的幼稚T細(xì)胞一起孵育。使用3D Cell Explorer每隔6秒采集一張圖像，持續(xù)約11分鐘。

試驗(yàn)結(jié)果：
 

 

觀察內(nèi)容

1. 由于這三種細(xì)胞的大小、密度以及折射率（RI）的不同，我們可以清楚地將它們區(qū)分開來。T細(xì)胞是最小和最密集的，因此它們?cè)赗I圖像上看起來最亮。巨噬細(xì)胞則相反；這些細(xì)胞很大，因此在RI圖像中它們較暗。樹突狀細(xì)胞通過其大量的膜突起很容易區(qū)分。
 

2. Nanolive活細(xì)胞成像的高時(shí)空分辨率使我們能夠觀察不同細(xì)胞類型之間的行為差異。視頻中最顯著的特征之一是樹突狀細(xì)胞膜突起的動(dòng)態(tài)行為。細(xì)胞膜不斷以快速、隨機(jī)的方式延伸出細(xì)胞表面，這種行為很可能與細(xì)胞感知外界環(huán)境信號(hào)有關(guān)。
 

3. 樹突狀細(xì)胞包膜含有檢測(cè)細(xì)胞因子、病原體相關(guān)和損傷相關(guān)分子模式的受體，抑制這些受體并觀察其對(duì)樹突狀細(xì)胞行為的影響是未來可能研究的課題。

 

案例二：T細(xì)胞和癌細(xì)胞互作

背景

免疫系統(tǒng)與癌癥之間的關(guān)系是復(fù)雜而動(dòng)態(tài)的。熒光顯微鏡是研究免疫細(xì)胞和癌細(xì)胞之間相互作用最常用的方法，但它有許多局限性，脆弱的原代免疫細(xì)胞受到耗時(shí)、復(fù)雜和昂貴的染色步驟的干擾，受到大量光毒性。相比之下，Nanolive成像提供了一種高分辨率、無標(biāo)標(biāo)記的方式對(duì)免疫細(xì)胞和癌細(xì)胞之間的相互作用進(jìn)行成像。

試驗(yàn)方法：

使用從OT-I小鼠分離的T細(xì)胞，其攜帶對(duì)卵清蛋白殘基257-264（SIINFEKL肽）有反應(yīng)的細(xì)胞受體，與來自MC38-OVA細(xì)胞系和表達(dá)卵清蛋白（OVA）抗原的結(jié)腸癌細(xì)胞一起孵育。

試驗(yàn)結(jié)果：

觀察內(nèi)容

1. T細(xì)胞和癌細(xì)胞之間的相互作用: T細(xì)胞接近并連接到結(jié)腸癌細(xì)胞表面（A）。癌細(xì)胞抵抗這種誘導(dǎo)凋亡的接觸，但隨后吸引了更多的T細(xì)胞。
2. 三個(gè)T細(xì)胞現(xiàn)在包圍著癌細(xì)胞，并通過不止一個(gè)T細(xì)胞（B）進(jìn)行接觸。
3. 細(xì)胞凋亡被激活，癌細(xì)胞收縮并開始失去其結(jié)構(gòu)（C）。
4. 癌細(xì)胞被中和（D）。
 

案例三：T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞互作

背景

Nanolive為確定T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞相互作用的基本動(dòng)力學(xué)提供了一個(gè)良好的解決方案，使復(fù)雜的細(xì)胞間相互作用能夠在空間和時(shí)間上以清晰的對(duì)比度和高分辨率被捕獲，從而允許對(duì)細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)的細(xì)節(jié)進(jìn)行檢查。

試驗(yàn)方法：

從C57BL/6小鼠中分離巨噬細(xì)胞，并用卵清蛋白肽、γ-干擾素和脂多糖處理以誘導(dǎo)抗原呈遞。從OT-1小鼠中分離T細(xì)胞。使用3D Cell Explorer每隔6秒采集一張圖像，持續(xù)16小時(shí)。對(duì)z軸上的數(shù)據(jù)應(yīng)用后處理數(shù)字著色標(biāo)尺，將空間信息添加到我們的圖像中（靠近培養(yǎng)皿底部的細(xì)胞為藍(lán)色，而遠(yuǎn)離培養(yǎng)皿的細(xì)胞為粉紅色）

試驗(yàn)結(jié)果：

觀察內(nèi)容

1. 由于Nanolive技術(shù)的非侵入性和允許長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)成像，能夠捕捉到T細(xì)胞介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞死亡和巨噬細(xì)胞-巨噬細(xì)胞循環(huán)的鏡頭。

2. 細(xì)胞類型通過其獨(dú)特的形態(tài)很容易識(shí)別：巨噬細(xì)胞比T細(xì)胞大。兩個(gè)T細(xì)胞接近并接觸巨噬細(xì)胞（A）。這種接觸足以使T細(xì)胞識(shí)別存在于巨噬細(xì)胞表面的抗原（B）并引發(fā)凋亡（C）。之后，相鄰的巨噬細(xì)胞識(shí)別細(xì)胞死亡，并開始吞噬（D）。

3. Nanolive高時(shí)空分辨率確保不會(huì)遺漏細(xì)節(jié)，甚至觀察到從死細(xì)胞到活細(xì)胞（E）的囊泡轉(zhuǎn)移。

4. 在后期數(shù)字化處理視頻突出Nanolive技術(shù)的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)：添加有關(guān)細(xì)胞深度等信息。
 

案例四：檢測(cè)抗腫瘤治療的效果

背景

不斷增殖是癌癥的重要特征之一�？贵w-藥物結(jié)合物（ADC）是近年來發(fā)展起來的一種新型癌癥治療藥物。ADC將單克隆抗體的靶向特異性與細(xì)胞毒性藥物的抗癌能力結(jié)合起來，使區(qū)分健康細(xì)胞和癌細(xì)胞成為可能，并大大減少了常規(guī)抗癌治療的副作用。Nanolive的非侵入性、無標(biāo)記和允許長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖；保證了測(cè)試抗癌治療有效性和安全性。本案例研究是與瑞士生物技術(shù)公司NBE Therapeutics合作進(jìn)行的。

試驗(yàn)方法：

腫瘤特異性ADC和同型ADC，兩種ADC在小鼠乳腺癌細(xì)胞系上進(jìn)行了測(cè)試。使用Nanolive每隔2秒拍攝一次圖像，持續(xù)60小時(shí)。將細(xì)胞隨時(shí)間的增殖量化為視野中細(xì)胞所占表面積的百分比（%融合度），繪制為線圖并覆蓋在處理上。
 

試驗(yàn)結(jié)果：

 

觀察內(nèi)容

1. Nanolive成像60小時(shí)，連續(xù)監(jiān)測(cè)細(xì)胞（每2秒一張圖像）。從得到的圖像可以很容易地計(jì)算出細(xì)胞融合率，從而可以量化處理過的細(xì)胞群的生長(zhǎng)或衰退，并將其與實(shí)驗(yàn)對(duì)照的性能進(jìn)行比較。在本病例研究中，暴露于對(duì)照同型ADC的細(xì)胞分裂不受干擾（A），而暴露于腫瘤特異性性ADC的細(xì)胞（B）在同一時(shí)期內(nèi)死亡（給藥后34小時(shí)30分鐘）。

2. 除了能夠進(jìn)行簡(jiǎn)單的細(xì)胞增殖分析外，Nanolive也能夠觀察細(xì)胞在反應(yīng)過程中發(fā)生的形態(tài)變化，提供細(xì)胞被殺死機(jī)制的參照。

3. 在添加腫瘤特異性ADC（白色箭頭，A，B）后早期觀察到內(nèi)吞作用（空泡形成）增加。脂滴（細(xì)胞內(nèi)的白色小結(jié)構(gòu)）的分布也發(fā)生了變化，在細(xì)胞凋亡完成之前聚集在細(xì)胞核周圍（C）。

4. 活細(xì)胞增殖分析與單細(xì)胞分辨率的結(jié)合是一個(gè)強(qiáng)大的組合，可以用來測(cè)試多種抗癌藥物的有效性和安全性。未來的研究可以考慮對(duì)每個(gè)細(xì)胞面積/質(zhì)量/體積形成的液泡的數(shù)量進(jìn)行量化，確定是否達(dá)到某個(gè)閾值才能完成細(xì)胞凋亡。
 

案例五：使用雙異性抗體藥物提高細(xì)胞毒性T細(xì)胞的療效

背景

細(xì)胞毒性T細(xì)胞是一種強(qiáng)大的效應(yīng)T細(xì)胞，能夠殺死帶有抗原復(fù)合物（肽-MHC）的靶細(xì)胞，該抗原復(fù)合物由T細(xì)胞受體（TCR）識(shí)別。然而，大多數(shù)T細(xì)胞無法識(shí)別和殺死腫瘤細(xì)胞，因?yàn)槠銽CR缺乏腫瘤特異性。通過在癌細(xì)胞上使用針對(duì)腫瘤相關(guān)抗原（TAA）的雙特異性抗體和T細(xì)胞上的CD3蛋白復(fù)合物結(jié)合，可以獨(dú)立于其TCR的特異性來定向和激活針對(duì)腫瘤細(xì)胞的任何T細(xì)胞。我們使用CX-A的自動(dòng)網(wǎng)格掃描成像模式，在高時(shí)空分辨率下實(shí)時(shí)跟蹤這一過程。這項(xiàng)研究是與瑞士生物技術(shù)公司Light Chain Bioscience合作進(jìn)行的。
 

試驗(yàn)方法：

人類癌細(xì)胞與設(shè)計(jì)用于靶向癌細(xì)胞上的腫瘤相關(guān)抗原（TAA）和T細(xì)胞上的CD3復(fù)合物的雙特異性抗體混合，比例為5 T細(xì)胞：1癌細(xì)胞。使用Nanolive CX-A上的5x5網(wǎng)格掃描模式，以4分鐘30秒每幀的速度采集圖像。隨后拼接生成的圖像以顯示細(xì)胞的群體水平反應(yīng)。
 

試驗(yàn)結(jié)果：

 

觀察內(nèi)容

CX-A的網(wǎng)格掃描模式產(chǎn)生的大視場(chǎng)使觀察TAAxCD3 bsAb對(duì)T細(xì)胞/癌細(xì)胞相互作用的影響成為可能。TAAxCD3 bsAb能夠使T細(xì)胞更接近其目標(biāo)癌細(xì)胞，從而使T細(xì)胞更活躍，T細(xì)胞介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞殺傷。
 

案例六：檢測(cè)靶向雙特異性抗體CD47的療效

背景

CD47使癌細(xì)胞能夠逃避免疫監(jiān)視和先天免疫細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞）的殺傷。免疫治療希望使用抗CD47抗體靶向和抑制CD47-SIRPα相互作用，進(jìn)而激活先天免疫，巨噬細(xì)胞破壞癌細(xì)胞。該試驗(yàn)展示了Nanolive的無標(biāo)記成像在臨床前測(cè)試抗CD47雙特異性抗體效力。這項(xiàng)研究是與瑞士Light Chain生物科學(xué)公司合作進(jìn)行的。
 

試驗(yàn)方法：

將人腫瘤細(xì)胞與（1）具有針對(duì)腫瘤相關(guān)抗原的高親和力TAAxCD47雙特異性抗體（治療組）或（2）低親和力CD47 bsAb（對(duì)照組）混合，并在人單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞存在下培養(yǎng)3小時(shí)。使用Nanolive以每30秒一幅圖像的速度獲取圖像。
 

試驗(yàn)結(jié)果：

 

觀察內(nèi)容

由于CD47（A）的阻斷，暴露于雙特異性抗體的癌細(xì)胞被巨噬細(xì)胞吞噬并迅速降解。相反，暴露于對(duì)照抗體的癌細(xì)胞抵抗來自巨噬細(xì)胞的攻擊，巨噬細(xì)胞的吞噬活性（B）受到阻礙。上面的詳細(xì)畫面說明了Nanolive活細(xì)胞成像如何評(píng)估癌癥免疫治療的新抗體。圖像的卓越分辨率允許觀察巨噬細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中被吞噬的癌細(xì)胞的消化情況（部分視頻放大）。
 

結(jié)論：

1.自動(dòng)化、無標(biāo)記成像，加快了數(shù)據(jù)收集；
2.捕捉細(xì)胞對(duì)藥物的真實(shí)反應(yīng)，而不是細(xì)胞對(duì)外界的反應(yīng)（例如光毒性），保證數(shù)據(jù)的真實(shí)性；
3.產(chǎn)生連續(xù)數(shù)據(jù)，允許細(xì)胞響應(yīng)的時(shí)間分辨率；
4.以定量、公正的方式驗(yàn)證功能；
5.由于其捕獲多種生物過程的能力，允許進(jìn)行同時(shí)觀察。
 

03   參考文獻(xiàn)

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