內(nèi)皮功能障礙作為一種病理狀態(tài)，被認(rèn)為是動脈粥樣硬化進(jìn)展中的一個關(guān)鍵事件。動脈壁中的脂質(zhì)積累是動脈粥樣硬化的明確特征之一，血管內(nèi)壁的內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是動脈粥樣硬化斑塊形成的早期事件。

自噬是一種保守的細(xì)胞過程，可降解和回收受損的細(xì)胞內(nèi)聚集體和細(xì)胞器。自噬過程伴隨巨噬細(xì)胞的增加。在人類中，自噬通過極化線粒體和阻止細(xì)胞色素c的釋放，也為動脈粥樣硬化斑塊的細(xì)胞提供了一種保護(hù)，以對抗細(xì)胞氧化應(yīng)激。動脈粥樣硬化進(jìn)展的特征是自噬受損。據(jù)報道，在動脈粥樣硬化期間，各種機(jī)制涉及自噬受損或自噬相關(guān)的分子變化。

眾所周知的自噬受體 p62/SQSTM1 (p62) 在細(xì)胞的選擇性自噬和細(xì)胞抗氧化反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。由于p62將包括脂質(zhì)在內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)自噬物質(zhì)運輸?shù)阶允审w進(jìn)行降解，自噬的破壞會導(dǎo)致 p62 積累。p62水平升高通常被認(rèn)為是自噬活性受到抑制的標(biāo)志。

有兩種主要的細(xì)胞內(nèi)降解系統(tǒng)：泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）和自噬-溶酶體系統(tǒng)。這些系統(tǒng)在檢測和去除錯誤折疊蛋白方面發(fā)揮著重要的監(jiān)視作用。由于 p62 作為一個橋梁，蛋白酶體抑制可以激活自噬。由于泛素化是可逆的，它在自噬中具有雙向作用，泛素化也及時參與調(diào)節(jié)自噬。

盡管有報道稱在受損細(xì)胞條件下p62水平升高表明自噬缺陷，但人們認(rèn)為p62的積累可能是一種適應(yīng)不良或細(xì)胞保護(hù)反應(yīng)，尤其是在動脈粥樣硬化中�；�于此，來自韓國尚志大學(xué)醫(yī)學(xué)院、延世大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科系、京畿大學(xué)生命科學(xué)系等的專家學(xué)者進(jìn)行了深入研究，旨在闡明在動脈粥樣硬化條件下 p62 介導(dǎo)的自噬在人內(nèi)皮細(xì)胞 (ECs ) 中的作用。相關(guān)研究成果發(fā)表在 International Journal Molecular Sciences 題為《P62 Links the Autophagy Pathway and the Ubiquitin–Proteasome System in Endothelial Cells during Atherosclerosis》。

實驗結(jié)果：

oxLDL 在共培養(yǎng)的 HUVEC 和 THP-1 細(xì)胞中誘導(dǎo)先天免疫反應(yīng)和炎癥

為了模擬動脈粥樣硬化條件下的血管狀況，共培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 (HUVEC) 和人單核細(xì)胞 THP-1 細(xì)胞，并用氧化低密度脂蛋白 (oxLDL、50 µg/mL) 處理 6、12、24 或 48 小時。然后從共培養(yǎng)物中收集上清液并使用 ELISA 測量 C1q 的水平，C1q 是一種先天免疫分子，是補(bǔ)體系統(tǒng)的經(jīng)典途徑的一部分。

在oxLDL處理后24小時，C1q仍在增加，但沒有進(jìn)一步增加 (圖1 A)。接下來，從共培養(yǎng)物中分離出的細(xì)胞裂解液在蛋白質(zhì)水平上進(jìn)行分析。值得注意的是，HUVECs 中的 C1q 蛋白水平與分泌的 C1q 水平相似 (圖1 B)。

此外，還分析了 oxLDL作用下THP-1細(xì)胞中被裂解的IL-1β蛋白水平，發(fā)現(xiàn)oxLDL處理后24小時，IL-1β被裂解最高，48小時時略有下降 (圖1 C)。采用BODIPY對HUVECs和THP-1細(xì)胞進(jìn)行染色，研究oxLDL處理后各細(xì)胞的脂質(zhì)沉積情況。在共培養(yǎng)的 HUVECs 和 THP-1 細(xì)胞中，在 0、6 和 24 小時檢測到 oxLDL 處理后的脂質(zhì)負(fù)荷，脂質(zhì)積累在 24 小時而不是在 6 小時時顯著增加 (圖1 D)。
 

圖 1  oxLDL 在共培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上的暴露

自噬被誘導(dǎo)但在動脈粥樣硬化條件下發(fā)生功能障礙

首先，檢測共培養(yǎng)中HUVECs 和 THP-1 細(xì)胞的自噬水平。自噬陽性 HUVECs 的數(shù)量在 oxLDL 暴露后 8 h 顯著增加，在 24 h 達(dá)到峰值，然后在 48 h 下降 (圖2 A)。在THP-1細(xì)胞中，自噬陽性細(xì)胞的數(shù)量在8 h時增加，但在48 h后仍保持在較高水平 (圖2 B)。

然而，這項研究主要集中在暴露于oxLDL的動脈粥樣硬化條件下受損的HUVECs。如圖1 D所示，確定脂質(zhì)被加載到HUVECs中，從而研究了自噬在清除 HUVECs 中沉積的脂質(zhì)中的作用。通過蛋白質(zhì)印跡分析了 HUVECs 中自噬相關(guān)蛋白Beclin1 、p62、LC3-II 的水平 (圖2 D)。

結(jié)果表明，與 THP-1 細(xì)胞相比，beclin-1 和 p62 蛋白水平均呈時間依賴性增加，但略有延遲。此外，在 oxLDL 暴露 24 小時后，LC3-II 的水平增加，但在 48 小時后下降。此外，溶酶體關(guān)聯(lián)膜蛋白2 (LAMP2) 蛋白水平逆轉(zhuǎn)為 p62 蛋白水平。出乎意料的是，在暴露于 oxLDL 后，LAMP2 的水平以時間依賴性方式降低。
 

圖 2  oxLDL暴露時共培養(yǎng)巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的自噬啟動

下調(diào) p62 誘導(dǎo)替代降解系統(tǒng)

為了更好地了解自噬和自噬受損在動脈粥樣硬化條件下的作用，在 oxLDL 暴露前，p62被siRNA沉默48小時。因此，當(dāng)與 oxLDL 共培養(yǎng) 24 小時時，siRNA處理的HUVECs中p62 mRNA 和蛋白水平均下調(diào)。長期暴露于oxLDL可損害內(nèi)皮細(xì)胞的自噬。

THP-1與HUVECs共培養(yǎng)時，沉默p62, HUVECs中的LC3-II降低，負(fù)載的脂質(zhì)相應(yīng)增加。同樣，代表自噬執(zhí)行的 LC3 陽性水平受到 p62 下調(diào)和蛋白酶體系統(tǒng)抑制劑的阻礙。與 LC3 相反，oxLDL暴露降低了LAMP2 mRNA水平，p62的下調(diào)沒有顯著改變LAMP2 mRNA水平。然而，LAMP2 的蛋白質(zhì)水平因 p62 下調(diào)而升高。此外，siRNA-p62 處理的 HUVECs 中 LAMP2 陽性信號略有增強(qiáng)，足以克服 oxLDL 損傷。

E3 連接酶參與動脈粥樣硬化條件下的自噬

通過qPCR在mRNA水平檢測E3連接酶的變化。Cul4 是 CRL E3 連接酶家族的成員，在oxLDL暴露于HUVECs后24 h表達(dá)增加，48 h表達(dá)減少 (圖3 B)。此外，在 p62 沉默的 HUVECs 中 mRNA 水平降低。另一種 E3 連接酶 NEDD4 是 HECT E3 連接酶的一個組成部分，其 mRNA 水平在oxLDL處理或p62敲低時沒有變化 (圖3 C)。

為了進(jìn)一步闡明自噬和蛋白酶體泛素系統(tǒng)在清除致動脈粥樣硬化物質(zhì)中的作用，將 p62-siRNA、MG132（蛋白酶體抑制劑）、heclin（HECT E3 連接酶抑制劑）和 MLN4924（CRL E3 連接酶抑制劑）注入暴露于oxLDL的細(xì)胞中 (圖3 D)。通過沉默 p62，與 si 對照處理的 HUVECs 相比，多聚泛素化蛋白FK2 檢測到的多泛素化蛋白是豐富的。相反，用 MG132 和 MLN4924 處理減少了多泛素化蛋白，但用 HECT E3 連接酶抑制劑 Heclin 處理沒有改變 (圖3 D)。
 

圖 3  E3 連接酶參與自噬

實驗結(jié)論：

總的來說，這項研究探索了p62介導(dǎo)的人內(nèi)皮細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)條件下的自噬。暴露于 oxLDL 后，脂質(zhì)在 ECs 中積累并誘導(dǎo)自噬，但在長期暴露于 oxLDL 后未能降解。細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過多會導(dǎo)致溶酶體功能障礙，蛋白酶體系統(tǒng)可以幫助緩解這一問題。

這項研究證明了在動脈粥樣硬化條件下溶酶體和蛋白酶體降解之間的相互作用，而未來也需要進(jìn)一步研究 E3 連接酶抑制劑的靶點、每種 E3 連接酶的作用以及特定的 E3 連接酶與自噬相關(guān)分子之間的相互調(diào)節(jié)機(jī)制。

參考文獻(xiàn)：Kim S, Lee W, Cho K. P62 Links the Autophagy Pathway and the Ubiquitin-Proteasome System in Endothelial Cells during Atherosclerosis. Int J Mol Sci. 2021 Jul 21;22(15):7791. doi: 10.3390/ijms22157791. PMID: 34360560; PMCID: PMC8346161.

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