血流通過血管壁主要產(chǎn)生兩種機(jī)械力：機(jī)械剪切應(yīng)力和機(jī)械拉伸應(yīng)力 (SS)。前者平行于血管的縱軸并作用于內(nèi)皮細(xì)胞，而SS 產(chǎn)生垂直于血管壁的力，作用于所有組成細(xì)胞，包括內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞 (VSMCs)、成纖維細(xì)胞等。

VSMCs是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的主要細(xì)胞成分，它承受著血壓施加的持續(xù)的SS。因此，VSMCs的增殖、凋亡、遷移、炎癥、分化和表型變化都與血管重塑和動(dòng)脈粥樣硬化等疾病密切相關(guān)。然而，導(dǎo)致 VSMCs 病理生理表現(xiàn)的機(jī)械力的潛在機(jī)制仍不清楚。

來自中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)系、中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院血管外科等單位的專家學(xué)者發(fā)現(xiàn)，小鼠的靜脈移植迅速發(fā)展為動(dòng)脈化或移植物粥樣硬化。組織病理學(xué)評估顯示，VSMCs 的凋亡和增殖同時(shí)增加，與移植物病變形成的速度成正比。重要的是，該團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)SS激活了氧化應(yīng)激系統(tǒng)中的蛋白二硫化物異構(gòu)酶(PDI)/NADPH氧化酶家族蛋白(NOX1)/活性氧(ROS)信號，導(dǎo)致 VSMC 增殖和凋亡的同時(shí)增加，這與某些VSMC亞型密切相關(guān)。

另一個(gè)重要的氧化還原信號通路是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 (ERS) 系統(tǒng), 由 PERK、IRE1α 和 ATF6 三個(gè)成分組成, 與 PDI、增殖和凋亡密切相關(guān)。這些蛋白質(zhì)是否也能被機(jī)械力激活，目前尚不清楚。

黃連，是一種傳統(tǒng)的常用中藥，具有藥用和食用價(jià)值。黃連的加工品已被廣泛應(yīng)用于臨床，用于治療腹瀉、眼炎、濕熱引起的女性腹部疾病等。其最重要的成分是黃連素 (小檗堿)，自 1960 年以來，已在中國廣泛用于治療感染性腹瀉、退燒和排毒等。

最近有報(bào)道稱，黃連素可以抑制動(dòng)脈粥樣硬化，改善血壓，具有抗高血糖，抗高血脂，抗癌等作用。這些發(fā)現(xiàn)促使研究人員探索黃連素是否可以阻止由機(jī)械力誘導(dǎo)的 VSMC 增殖和凋亡的同時(shí)增加。

因此，該團(tuán)隊(duì)于 Life Sciences  發(fā)表了題為《Berberine inhibits proliferation and apoptosis of vascular smooth muscle cells induced by mechanical stretch via the PDI/ERS and MAPK pathways》的研究成果。在這項(xiàng)研究中，首次提供了黃連素抑制 PDI/ERS/MAPK 信號通路的證據(jù)，從而減弱了響應(yīng)于機(jī)械拉伸的 VSMC 增殖和凋亡的同時(shí)增加。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

黃連素抑制SS誘導(dǎo)的VSMCs增殖和凋亡

為了探索黃連素的潛在保護(hù)作用，VSMCs 用 100 μM 黃連素或 500 μM 桿菌肽預(yù)處理 1 小時(shí)，再進(jìn)行機(jī)械拉伸（10% ）持續(xù)1 小時(shí)，然后培養(yǎng) 23 小時(shí)。結(jié)果表明，與未使用黃連素的陰性對照組相比，單獨(dú)使用黃連素對靜止VSMCs的增殖和凋亡沒有影響。然而，黃連素能明顯抑制SS誘導(dǎo)的VSMC增殖和凋亡的增加（圖1）。由于增殖和凋亡是動(dòng)脈粥樣硬化的主要標(biāo)志物，這些數(shù)據(jù)表明黃連素可能減緩由高血壓引發(fā)的病理生理變化。
 

圖 1 黃連素和桿菌肽對SS誘導(dǎo)的VSMCs增殖和凋亡同時(shí)增加的影響

黃連素降低 SS 誘導(dǎo)的 VSMCs 中 MAPK 的磷酸化

之前報(bào)道過SS同時(shí)激活VSMCs中MAPK信號通路的三個(gè)成員，但是否存在干預(yù)尚不清楚。為了探討黃連素對VSMCs增殖和凋亡的潛在影響機(jī)制，先用黃連素或桿菌肽處理細(xì)胞1 h，再用SS處理細(xì)胞10 min，然后收集細(xì)胞用于蛋白質(zhì)印跡分析。如圖2所示, 10 分鐘的機(jī)械應(yīng)力激活了三種不同的 MAPK，磷酸化的 ERK、JNK 和 p38MAPK 水平上調(diào)，而這些蛋白質(zhì)的總水平大致保持不變。動(dòng)力學(xué)分析表明，該響應(yīng)早在5min就出現(xiàn)了，最大誘導(dǎo)時(shí)間不晚于30min，此后反應(yīng)下降。因此，黃連素以濃度依賴性方式降低了三種磷酸化 MAPKs 的水平。
 

圖 2  黃連素對 VSMCs 中 MAPK 磷酸化的影響

黃連素抑制 SS 刺激的 VSMCs 中 PDI 激活的上調(diào)

為了研究黃連素對 SS 誘導(dǎo)的 PDI 活化 (OX-PDI) 的影響，在用 10% 的SS 刺激之前，VSMCs 用不同濃度（10、100、200 或 500 μM）的黃連素預(yù)處理 1 h。如圖3所示，觀察到黃連素濃度與 OX-PDI 水平呈負(fù)相關(guān)。

接下來，研究了黃連素對 SS 誘導(dǎo)的總PDI 的影響。用黃連素或桿菌肽預(yù)處理 1 小時(shí)的 VSMCs 進(jìn)行 SS（10%，1 h），然后再培養(yǎng) 23 h。蛋白質(zhì)印跡顯示，黃連素不影響靜止細(xì)胞中的基礎(chǔ) PDI 表達(dá)，但可以抑制 SS 誘導(dǎo)的 PDI 上調(diào)。這些結(jié)果表明，PDI 通過其氧化/還原形式，在 SS 誘導(dǎo)的 VSMCs 細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。
 

圖 3 黃連素和桿菌肽對體外 SS 誘導(dǎo)的 VSMCs 氧化性和總 PDI 上調(diào)的影響

黃連素抑制 SS 刺激的 VSMCs 中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

由于 PDI 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中非常重要的分子伴侶和異構(gòu)酶，實(shí)驗(yàn)試圖研究 SS 是否誘導(dǎo) ERS。為此，VSMCs 經(jīng)受了不同時(shí)間段的 SS（圖 4）。重要的是，SS 迅速激活了三種 ERS 信號分子，即 PERK、IRE1α 和 ATF6。為了確定黃連素是否影響 SS 誘導(dǎo)的 ERS，在 SS 施加之前用黃連素或桿菌肽預(yù)處理細(xì)胞。我們發(fā)現(xiàn)所有三個(gè) ERS 信號分子都被下調(diào)。這些結(jié)果表明 ERS 參與了 SS 誘導(dǎo)的 VSMCs 中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，其可被黃連素和桿菌肽抑制。
 

圖 4 黃連素和桿菌肽對體外SS誘導(dǎo)的VSMCs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響

接下來，實(shí)驗(yàn)探討了PDI與MAPK、MAPK與ERS信號分子之間的關(guān)系以及MAPKs在介導(dǎo)黃連素中的作用，結(jié)果表明在 SS 刺激的 VSMCs 中，黃連素通過 MAPK 途徑降低了 OX-PDI 和 ERS 信號通路，MAPK 抑制劑降低 SS 誘導(dǎo)的 VSMCs 中 PDI 激活和 ERS 的上調(diào)。

然后，實(shí)驗(yàn)還研究了ERS 和黃連素之間的潛在相互作用，結(jié)果表明 ERS 信號在黃連素治療的效果中起作用，ERS 信號分子的抑制減弱了 VSMCs 中由 SS 誘導(dǎo)的 PDI 激活的上調(diào)。在高血壓期間，由血壓升高引起的 SS 可能對血管壁產(chǎn)生長期影響，而黃連素可以降低由長期 SS 誘導(dǎo)的 VSMCs 中的 PDI 激活和 ERS 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

最后，為了進(jìn)一步闡明 SS 誘導(dǎo) VSMCs 細(xì)胞凋亡的機(jī)制，實(shí)驗(yàn)研究了半胱天冬酶的表達(dá)。延長機(jī)械拉伸激活了促凋亡 caspase-12 和 caspase-3，這可能解釋了拉伸引發(fā)的細(xì)胞凋亡的出現(xiàn)，而黃連素可以降低 SS 誘導(dǎo)的 VSMCs 中 caspase-3 和 caspase-12 的表達(dá)，這可能解釋了其對 SS 誘導(dǎo)的血管重塑的抗凋亡作用。
 

實(shí)驗(yàn)結(jié)論：

在這項(xiàng)研究中，檢測了黃連素對機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的VSMCs增殖和凋亡的影響，并得出了幾個(gè)重要的發(fā)現(xiàn)。首先，黃連素顯著抑制 SS 誘導(dǎo)的 VSMCs 的增殖和凋亡。其次，機(jī)械拉伸顯著增加了 PDI 的氧化、PERK 和 IRE1α 的磷酸化、ATF6 的激活、MAPKs 的磷酸化以及 caspase-3 和 caspase-12 的激活。所有這些影響都被黃連素所減弱。第三，MAPK 抑制劑降低了 OX-PDI 和三個(gè) ERS 信號分子的水平，而常見的 ERS 抑制劑下調(diào)了 OX-PDI ，但沒有降低磷酸化的 MAPK 水平。

這些結(jié)果不僅有助于了解與血流動(dòng)力學(xué)變化相關(guān)的血管疾病，而且有助于了解這些疾病的分子發(fā)病機(jī)制和治療方法。更重要的是，該研究結(jié)果進(jìn)一步闡明了傳統(tǒng)藥物黃連素的作用機(jī)制，并為預(yù)防和治療高血壓引起的血管重塑提供了新的治療策略。

參考文獻(xiàn)：Wang L, Deng L, Lin N, Shi Y, Chen J, Zhou Y, Chen D, Liu S, Li C. Berberine inhibits proliferation and apoptosis of vascular smooth muscle cells induced by mechanical stretch via the PDI/ERS and MAPK pathways. Life Sci. 2020 Oct 15;259:118253. doi: 10.1016/j.lfs.2020.118253. Epub 2020 Aug 11. PMID: 32795536.

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