Axygen 凝膠成像系統(tǒng)-BL（GDBL-1000）是一種易于使用的凝膠圖像捕獲系統(tǒng)，可使用 302 nm 波長紫外光 (UV 302) 生成高質(zhì)量的16位TIFF圖像)、365 nm 波長紫外光 (UV 365)、470 nm 藍光或 Epi 白光。藍色光源可以使用溴化乙錠替代染料，避免紫外線照射和溴化乙錠的潛在致突變效應。

      在這里，我們在Axygen凝膠成像系統(tǒng)-BL中使用藍光與溴化乙錠替代染色劑SYBR®Safe和GelGreen®進行了一項限制檢測研究，并使用UV 302與溴化乙錠進行了對比。對每個凝膠染色和光照組合的兩個DNA片段(~6107 bp和~1746 bp)的連續(xù)稀釋度進行評估，并使用凝膠分析軟件從凝膠圖像中測定最低濃度為1D。將SYBR®Safe和GelGreen®染色劑與藍光結(jié)合使用，得到的DNA檢測限度與使用溴化乙啶染色劑和紫外光302光照暴露的限度相當，證明了該儀器的多用途性。此外，還比較了藍光和紫外光302照射下DNA的轉(zhuǎn)化效率。
 
材料/方法
DNA 樣品制備

      質(zhì)粒 DNA pCMV-SPORT-Bgal（Thermo Fisher Cat. No. 10586-014）在HindIII(693)和ScaI(6800) 位點使用限制性內(nèi)切酶，雙重消化進行切割以產(chǎn)生兩個片段，長度約為 6107bp和1746bp。簡而言之，將酶 HindIII-HF®（New England Biolabs (NEB) Cat. No. R3104）和 ScaI-HF®（NEB Cat. No. R3122）與質(zhì)粒 DNA 以1.0µL酶/1.0µg DNA 的比例混合10X CutSmart® 緩沖液（NEB 目錄號 B7204 S），用康寧分子生物學級水（46-000-CM）稀釋十倍。雙酶切在 37℃下孵育20分鐘，然后通過在 80℃下加熱滅活 20 分鐘。消化后的DNA儲存在-20℃。
 
凝膠電泳

       通過將 2.25g瓊脂糖 LE（AGR-LE-100）熔化在 225 mL 1X TBE 緩沖液中來制備瓊脂糖凝膠（1%），該緩沖液是通過稀釋 10X TBE 緩沖液（AGR-LE-100）制備的。46-011-CM) 十倍于康寧分子生物學級水中。就在將凝膠倒入帶有兩個 20 孔梳子的 15 x 15 cm 托盤之前，添加凝膠染料并使用 11.25 µL 溴化乙錠（Sigma-Aldrich 目錄號 E1510-10ML）、22.5 µL SYBR Safe DNA 混合凝膠染色劑（Thermo Fisher Cat. No. S33102），或 22.5 µL GelGreen 核酸凝膠染料（41005）。將固化的凝膠轉(zhuǎn)移到 Axygen® 水平凝膠盒（HGB-15）的主罐中，用 1X TBE 緩沖液填充至最大填充線。將 Axygen 1 Kb DNA 階梯（M-DNA-1kb）添加到兩排泳道 1、20、21 和 40 的孔，6 µL/孔。對于 18 個樣品，消化的 DNA 以 1:2 進行系列稀釋，與 6X DNA 凝膠加載染料（Thermo Fisher Cat. No. R0611）混合，并加載到12 µL/孔進入泳道 2 至 19 和 22 至 39，加載的 DNA 總量從泳道 2 和 22 中的 200.00 ng 到泳道 19 和 39 中的 1.50 pg。凝膠在 110 伏恒定電壓下運行 80 分鐘.對于每個凝膠染色，DNA 樣品獨立運行兩次，每個凝膠染色的每個 DNA 數(shù)量總共有四個泳道。
 
凝膠成像和分析

       凝膠電泳后，立即使用 Axygen Gel Documentation System-BL 對每個凝膠進行成像。對于溴化乙錠染色的凝膠，使用 UV 302 光照射凝膠。對于用 SYBR Safe 和 GelGreen 染色的凝膠，使用藍光照射凝膠。對于所有凝膠圖像，使用泳道 1 和 21 中的梯子根據(jù)感興趣區(qū)域 (ROI) 自動選擇曝光時間。使用 TotalLab 1D 凝膠分析軟件（14.0 版）分析凝膠圖像，以及 DNA 片段大小和濃度是根據(jù)使用 1 Kb DNA 梯的校準確定的。可以檢測到具有可量化 DNA 量 (> 0.00 ng) 的最低樣品的 DNA 量被確定為每個凝膠染色的檢測限。
 
轉(zhuǎn)換效率

       通過轉(zhuǎn)化效率研究確定了 UV 302 和藍光照射對 DNA 質(zhì)量的影響。質(zhì)粒 DNA pCMV-SPORT-Bgal 在分子生物學級水中稀釋至 2.5 ng/µL，并在 1.7 mL 微量離心管（3207）中分裝到 10 µL 體積中。
       對于每項研究，每個管都在 Axygen 凝膠成像系統(tǒng)-BL 中暴露于藍光或 UV 302 光下 1、2、4、7 或 10 分鐘。未暴露于藍光或 UV 302 光的儲備 DNA 用作陽性對照。 MAX Efficiency® DH5α™ 感受態(tài)細胞（Thermo Fisher Cat. No. 18258-012）用 DNA 樣品轉(zhuǎn)化。簡而言之，將細胞在冰上解凍，并在每個冷卻的 17 x 100 毫米聚丙烯管中用 1 微升 DNA 等分100 微升。細胞在冰上孵育30分鐘，42°C熱激45秒，放冰2分鐘。細胞用 0.9 mL S.O.C.按 1:10 稀釋。培養(yǎng)基（46-003-CR）并在 37°C 下以 225 rpm 搖動孵育 1 小時。使用 1:100 稀釋培養(yǎng)物S.O.C.培養(yǎng)基，將 100 µL 稀釋液涂抹在含有 100 µg/mL 氨芐青霉素、60 µg/mL X-gal 和 0.1 mM IPTG（L1902）的 LB 瓊脂平板上，用于過夜培養(yǎng)。計算菌落形成單位 (CFU) 的數(shù)量以確定轉(zhuǎn)化效率。
 
結(jié)果/討論

       凝膠電泳后，立即使用 Axygen® Gel Documentation System-BL 對每塊凝膠進行成像。用溴化乙錠染色的凝膠用 UV 302 光照射，而用 SYBR® Safe 和 GelGreen 染色的凝膠用藍光照射。從代表性 SYBR Safe 凝膠圖像中可以看出，泳道 1、20、21 和 40 包含具有大小介于 300 至 10,000 bp 之間的 DNA 條帶的 Kb DNA 階梯（圖 1）。在泳道 2 和 22 中可以觀察到最粗和最亮的條帶，代表大約 ~6107 bp 和 ~1746 bp DNA 片段，其中接收了 200.00 ng 的總 DNA。隨著 DNA 量在凝膠上從左到右稀釋，樣品 DNA 條帶的厚度和亮度也降低。

        通過使用 TotalLab 1D 凝膠分析軟件并將樣品 DNA 條帶校準到已知的 DNA 條帶大小和加載到 1 Kb 階梯中的數(shù)量，計算出每個泳道中檢測到的 DNA 量。無論凝膠染色或光源如何，在每個泳道中檢測到的 DNA 量在整個凝膠中都減少，與加載的 DNA 量直接相關(guān)（圖 2）。根據(jù)對 1 Kb DNA 階梯的校準，確定并計算出可檢測和計算的最低 DNA 量，并使用核酸凝膠染色劑和光源類型的每種組合進行比較。檢測限列于表 1 中，作為從 4 次獨立實驗中檢測到的最低 DNA 量范圍。使用帶有 UV 302 光的溴化乙錠，較大的 DNA 片段 (~6107 bp) 的檢測限低至 6.25 ng，而較小的 DNA 片段 (~1746) 的檢測限低至 50.00 ng。使用藍光 SYBR Safe DNA 凝膠染色劑產(chǎn)生的檢測限與兩種 DNA 片段的溴化乙錠/UV 302 檢測限相當。然而，使用帶有藍光的 GelGreen 核酸凝膠染色劑導致檢測限低至 3.13 ng~6107 bp 片段和 ~1746 bp 片段的 12.5 ng。對于 GelGreen 核酸凝膠染料，與溴化乙錠或 SYBR 安全檢測限相比，4 項獨立研究的檢測限變化范圍更大。當納入檢測限范圍時，使用帶有藍光的 SYBR Safe 或 GelGreen 染料證明

       檢測限至少與使用溴化乙錠和 UV 302 光相當。UV 302 光和藍光照射對 DNA 質(zhì)量的影響是通過對 MAX Efficiency DH5α 感受態(tài)細胞進行轉(zhuǎn)化效率研究來評估的，這些細胞的 DNA 已經(jīng)暴露于 UV 302 或藍光下 1 到 10 分鐘。暴露于 UV 302 的 DNA 顯示UV 302 暴露 2 分鐘后轉(zhuǎn)化效率為陽性對照（無光暴露）的一半，UV 302 暴露 10 分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化效率為 0（即未形成菌落）（圖 3）。然而，暴露于藍光下的 DNA 并未表現(xiàn)出轉(zhuǎn)化效率隨時間的下降，在藍光暴露 10 分鐘的過程中保持與陽性對照相當?shù)?CFU 水平。

結(jié)論

• Axygen® 凝膠文檔系統(tǒng)-BL 與常用的核酸凝膠染料兼容，包括溴化乙錠、SYBR® Safe 和 GelGreen®。
• Axygen 凝膠文檔系統(tǒng)-BL 具有藍光功能，可與溴化乙錠替代染料一起使用，從而在檢測限研究中具有相當?shù)撵`敏度。
• Axygen Gel Documentation System-BL 的藍光特性不會對 DNA 的質(zhì)量產(chǎn)生負面影響，這是通過將 DNA 直接暴露在光線下長達 10 分鐘后的轉(zhuǎn)化效率來衡量的。

表 1. 檢測到的最低 DNA 量范圍 (ng)

染色/光源	埃特布爾/紫外線 302	SYBR 安全/BL	凝膠綠/BL
~6107 bp 波段	6.25-12.50	6.25-12.50	3.13-6.25
~1746 bp 波段	50.00-100.00	50.00	12.50-25.00

每次測量使用 N = 4 個波段。 EtBr = 溴化乙錠； UV 302 = 302 nm 波長的紫外光； BL = 藍光。 圖1.代表性凝膠圖像。使用 1X SYBR Safe 核酸染色劑澆鑄 1% 瓊脂糖凝膠。將被切割成兩個片段（6107 bp 1746 bp）的質(zhì)粒 DNA pCMVSPORT-Bgal 的 1:1 稀釋系列添加到泳道2至19和 22 至 39 中，泳道中的量最高（200.00 ng）2 和 22 以及泳道 19 和 39 中的最低數(shù)量 (1.50 pg)。將 1 Kb 梯形 DNA 標記物 (6 µL) 添加到泳道 1、20、21 和 40。電泳后，使用 Axygen 凝膠文檔系統(tǒng)-BL 用藍光照射瓊脂糖凝膠以進行圖像捕獲。
  圖 2. DNA 定量檢測限。檢測到的總 DNA 量（根據(jù)將樣品校準到 Axygen 1 Kb DNA 分子量標準而確定）在整個凝膠中減少，與加載的 DNA 量減少直接相關(guān)。顯示了來自用藍光照射的 SYBR Safe 染色凝膠的代表性數(shù)據(jù)。條帶 1 ~6107 bp，條帶 2 ~1746 bp。
 
圖 3. DNA 暴露在光下的轉(zhuǎn)化效率。將 DNA 等分試樣直接暴露于 UV 302 或藍光下長達 10 分鐘。暴露的 DNA 的轉(zhuǎn)化效率是通過使用 MAX Efficiency DH5α 感受態(tài)細胞確定的，該細胞使用光照后的 DNA。暴露于 UV 302 的 DNA 的轉(zhuǎn)化效率在暴露 10 分鐘的過程中顯著降低至 0，而與陽性對照（無光暴露）相比，暴露于藍光的 DNA 的轉(zhuǎn)化效率沒有顯著變化。 N = 3 項獨立研究。黑線 = 無光陽性對照的平均值。