臺盼藍(lán)、AO/PI熒光計(jì)數(shù)、明場計(jì)數(shù)染色法區(qū)別及所適用細(xì)胞樣品類型
瀏覽次數(shù):23731 發(fā)布日期:2021-5-12
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在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,細(xì)胞濃度、活率的檢測是最基礎(chǔ)的一步,
不同類型的細(xì)胞適用不同的染色方法。
最常見的計(jì)數(shù)方法是
臺盼藍(lán)染色原理,這種跨膜染料通過觀察活死細(xì)胞形態(tài)來判斷細(xì)胞活率,中心透亮未著色的為活細(xì)胞,被著色呈現(xiàn)實(shí)心的為死細(xì)胞。近年來隨著細(xì)胞治療行業(yè)的進(jìn)步,臺盼藍(lán)染色原理已經(jīng)不能滿足復(fù)雜的細(xì)胞樣品的計(jì)數(shù),比如原代細(xì)胞中的碎片、PBMC中殘留的紅細(xì)胞血小板等雜質(zhì)碎片、培養(yǎng)后期的細(xì)胞,尤其在干細(xì)胞、CAR-T、NK等細(xì)胞治療領(lǐng)域臺盼藍(lán)計(jì)數(shù)方法的缺陷尤為突出。
圖1 臺盼藍(lán)染色原理檢測不同階段的細(xì)胞
隨之衍生出的
AO/PI熒光計(jì)數(shù)方法(前幾期有普及過),采用核酸特異性標(biāo)記原理,AO(吖啶橙,小分子染料,488激發(fā),525發(fā)射)標(biāo)記細(xì)胞核酸發(fā)綠色熒光,PI(碘化丙啶,大分子染料,535激發(fā),600發(fā)射)標(biāo)記死細(xì)胞核酸發(fā)紅色熒光,根據(jù)活死細(xì)胞熒光不同直接排除雜質(zhì)碎片的干擾,彌補(bǔ)了臺盼藍(lán)的不足。AO/PI熒光計(jì)數(shù)方法在干細(xì)胞、CAR-T、NK等細(xì)胞治療領(lǐng)域廣受科研工作者的喜愛。
圖2 臺盼藍(lán)和AO/PI熒光方法檢測不同階段的細(xì)胞
針對常規(guī)傳代培養(yǎng)的細(xì)胞和比較復(fù)雜的細(xì)胞都有了相應(yīng)的計(jì)數(shù)方法,幫助我們準(zhǔn)確分析細(xì)胞的濃度、活率、平均直徑等等,還有一類細(xì)胞是需要借助紙片微載體培養(yǎng)的,這類細(xì)胞的生長成球狀,很難實(shí)現(xiàn)在線計(jì)數(shù),需要借助專門的裂解液,使細(xì)胞裂解后得到裸核,通過檢測裸核實(shí)現(xiàn)細(xì)胞濃度的檢測,但是這種裂解液對臺盼藍(lán)和熒光試劑均有影響,會使臺盼藍(lán)團(tuán)成絮狀物,使AO/PI的熒光發(fā)生猝滅,這種細(xì)胞的裸核計(jì)數(shù)用最經(jīng)典的臺盼藍(lán)和AO/PI熒光方法均無法實(shí)現(xiàn)。
圖3 裂解后的裸核臺盼藍(lán)染色視野和AO/PI熒光染色視野
面對這種細(xì)胞我們Rigel除了臺盼藍(lán)活率計(jì)數(shù)、AO/PI熒光計(jì)數(shù)法,還有第三種計(jì)數(shù)方法,細(xì)胞計(jì)數(shù)—
明場計(jì)數(shù)法,這種方法針對只需要檢測細(xì)胞的生長濃度,不需要檢測活率的實(shí)驗(yàn),對于上述提到的紙片微載體培養(yǎng)后裂解的細(xì)胞,不需要染色液直接細(xì)胞樣品上樣即可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞濃度計(jì)數(shù)。
圖4 細(xì)胞裂解后裸核的檢測
不同的細(xì)胞類型有不同的檢測方法,我們Countstar Rigel熒光細(xì)胞分析儀同時提供明場細(xì)胞計(jì)數(shù)、臺盼藍(lán)活率計(jì)數(shù)、AO/PI熒光法計(jì)數(shù)這三種方法,配備
CCD高清攝像頭,獲取細(xì)胞真實(shí)的濃度,滿足細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測需求。