測量外泌體的粒徑分布一直以來都是外泌體表征的重要組成部分。但是由于外泌體的尺寸僅為30~200 nm，所以必須借助一些特殊的檢測手段才能夠?qū)�這種在光學(xué)顯微鏡下不可視的顆粒進行觀測。本篇就外泌體粒徑測量技術(shù)的發(fā)展進行簡述，并對不同技術(shù)的差異進行比較。

一、電鏡技術(shù)

在外泌體發(fā)現(xiàn)的早期，由于還沒有專門針對這類尺寸顆粒的分析方法，因此直接在電鏡下面觀察粒徑并統(tǒng)計成為了最早的外泌體粒徑統(tǒng)計方法。但是這種方法費時費力，且通量低，在面對臨床和科研中的大量樣本時顯得十分無力。

文獻中外泌體在電鏡TEM模式下的經(jīng)典形態(tài)

二、動態(tài)光散射技術(shù) & 納米粒子跟蹤分析技術(shù)

由于外泌體與材料學(xué)所合成的脂質(zhì)體在形態(tài)上十分相似，因此用于脂質(zhì)體表征的動態(tài)光散射技術(shù)（DLS）便被應(yīng)用于外泌體的尺寸測量上。DLS利用光射到遠小于其波長的小顆粒上時會產(chǎn)生瑞利散射現(xiàn)象，通過觀察散射光的強度隨時間的變化推算出溶液中顆粒的大小。但是這種技術(shù)會受到測量物質(zhì)的顏色、電性、磁性等理化特性的影響，并且對于灰塵和雜質(zhì)十分敏感。因此使得DLS在測量尺寸較小的粒子時，測量出的粒徑與實際的分布具有較大的偏差。

為了彌補DLS的短板，納米粒子跟蹤分析（NTA）技術(shù)孕育而生。這種技術(shù)采用激光散射顯微成像技術(shù)，用于記錄納米粒子在溶液中的布朗運動軌跡，并通過Stokes-Einstein方程推算粒子大小。這種技術(shù)能夠?qū)?0~1000 nm的粒徑進行測量，因此能夠提供更為精確地粒徑數(shù)據(jù)。在諸多文獻的測試中均取得了較DLS更好的精度，因此成為目前最為主流的外泌體尺寸測量手段。

NTA技術(shù)的工作原理與DLS技術(shù)在測量不同尺寸納米球的數(shù)據(jù)對比�？梢娤啾扔贒LS，NTA測量的粒徑分布更為精確。

雖然NTA取得了比DLS 更高的精準性，但是隨著外泌體研究的深入，其局限性也十分明顯。首先NTA僅能夠測量溶液中顆粒的平均粒徑尺寸，但是NTA無法分辨其中的外泌體、囊泡、脂蛋白，也不能區(qū)別不同源性的外泌體。這直接限制了外泌體粒徑表征的意義，使得研究者很難探究外泌體尺寸與外泌體來源之間的關(guān)系。另外NTA本身對于測試時的溫度、濃度和校準都有著較高要求，因此使得NTA在測試較小的粒子時其精度仍不能達到令人滿意的效果，其測試結(jié)果卻仍與電鏡、AFM等成像技術(shù)所觀測到的粒徑存在著明顯差異。

外泌體在TEM下的成像及粒徑統(tǒng)計與NTA測量的結(jié)果對比�？梢奛TA測量到的粒徑要比TEM直接測量的結(jié)果大50~100 nm。

三、單粒子干涉反射成像技術(shù)

為了解決上述在實際測試中的問題，一種新型的單粒子干涉反射成像傳感器（SP-IRIS）技術(shù)孕育而生。這種技術(shù)摒棄了布朗運動軌跡追蹤方法，通過基底與顆粒形成的相干光進行成像，通過成像后的亮度來直接計算納米粒子的大小。從而避免了NTA測量粒徑軌跡誤差大的短板，擁有更高的靈敏度和精度，即使對于NTA無法區(qū)分的40 nm與70 nm的粒子混合溶液也依然能夠取得很好的分辨率。

SP-IRIS的原理及芯片微陣列打印的成像效果和對混合不同粒徑小球的區(qū)分效果�？梢奡P-IRIS技術(shù)擁有更高的測試通量和測量精度。

得益于這種高精度測量方法，越來越多的研究者終于能夠測量到與電鏡直接觀測相當(dāng)?shù)牧�徑。這種優(yōu)勢所帶來的效果不單單是能夠讓TEM的數(shù)據(jù)與納米粒子表征的數(shù)據(jù)更為一致，同時還能夠表征不同來源的外泌體之間的粒徑差異。

SP-IRIS、NTA和TEM統(tǒng)計同一樣品時所測量的粒徑分布。SP-IRIS在測量不同尺寸的外泌體時，測量的粒徑與TEM的尺寸統(tǒng)計基本一致，而NTA統(tǒng)計的粒徑則比TEM大約50 nm。此外SP-IRIS技術(shù)還能夠提供不同來源外泌體的尺寸差異，能夠看出CD9來源的外泌體要比其它來源的外泌體大~10 nm。

SP-IRIS的另一個優(yōu)勢在于能夠更換激光源的波長，因此除了能夠?qū)崿F(xiàn)外泌體的形貌成像外，還能夠?qū)崿F(xiàn)單外泌體的熒光成像。使得單外泌體的熒光共定位成為可能，研究者通過這種單外泌體熒光成像能夠研究單外泌體的表型、載物、來源等生物信息。

使用SP-IRIS 對受傷組和對照組小鼠不同時間點的血清CD9、CD81來源外泌體的分泌量監(jiān)測�？梢钥吹紺D81來源的外泌體的分泌量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，而CD9來源的外泌體分泌量則一直在增加。

綜上所述，由于SP-IRIS技術(shù)的高精度、高靈敏度、可做單外泌體熒光成像的優(yōu)勢，目前有越來越多的學(xué)者開始對比NTA技術(shù)和SP-SPIS技術(shù)，其結(jié)果均認為SP-SPIS技術(shù)測試的效果要明顯優(yōu)于NTA，這其中也不乏Cell等高水平期刊。相信在不久的將來，SP-IRIS技術(shù)將會越來越普及，為研究者研究外泌體打開新的大門。

參考文獻：

[1]. Ayuko Hoshino, et al, Extracellular Vesicle and Particle Biomarkers Define Multiple Human Cancers,cell, 2020, 182, 1–18.
[2]. Oguzhan Avci, et al., Interferometric Reflectance Imaging Sensor (IRIS)—A Platform Technology for Multiplexed Diagnostics and Digital Detection, Sensors 2015, 15, 17649-17665.
[3]. George G. Daaboul, et al, Digital Detection of Exosomes by Interferometric Imaging, Scientific Reports,6, 37246.
[4]. Federica Collino, et al, Extracellular Vesicles Derived from Induced Pluripotent Stem Cells Promote Renoprotection in Acute Kidney Injury Model, Cells 2020, 9, 453.
[5]. Daniel Bachurski, et al, Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis – An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView, JOURNAL OF EXTRACELLULAR VESICLES 2019, 8, 1596016.
[6]. Robert D. Boyd, et al, New approach to inter-technique comparisons for nanoparticle size measurements; using atomic force microscopy, nanoparticle tracking analysis and dynamic light scattering, Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects 387,2011, 35– 42.