eccDNA是染色體外的一種特殊的環(huán)狀DNA，從它的出現(xiàn)至今已長(zhǎng)達(dá)數(shù)年，但在起初的很長(zhǎng)一段時(shí)間里并未得到人們的重視。隨著高通量技術(shù)的發(fā)展，eccDNA(extrachromosomal circular DNAs，eccDNAs)作為染色體外的環(huán)狀DNA的研究也進(jìn)一步深入。在國(guó)際學(xué)術(shù)期刊《Nature》和《Cell》上相繼發(fā)表的關(guān)于eccDNA在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中具有重要功能的報(bào)道使eccDNA成為了基因組學(xué)研究中的一個(gè)爆點(diǎn)。這兩篇文章中認(rèn)為eccDNA能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞中原癌基因的表達(dá)，這一重要發(fā)現(xiàn)使eccDNA成為科研界關(guān)注的熱點(diǎn)話題。

然而關(guān)于eccDNA在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的空間位置及作用機(jī)理仍未可知。近期，美國(guó)斯坦福大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)在bioRxiv 預(yù)先發(fā)表了一篇題目為“EcDNA hubs drive cooperative intermolecular oncogene expression”的文章，對(duì)癌癥細(xì)胞中ecDNA hubs（ecDNA聚集成簇）在致癌基因的表達(dá)中發(fā)揮重要的作用提出了一個(gè)新的分子機(jī)制，這為解析ecDNA在癌癥細(xì)胞中的作用提出一個(gè)新方向，也為癌癥治療提供了新的理論基礎(chǔ)。 發(fā)表平臺(tái)： bioRxiv 
發(fā)表日期： 2020.11.20
實(shí)驗(yàn)方法:  WGS, RNA-seq, ChIP（以上服務(wù)云序均可提供）
文章鏈接：EcDNA hubs drive cooperative intermolecular oncogene expression 此前研究發(fā)現(xiàn)ecDNA是大小約100kb-幾Mb的雙鏈環(huán)狀DNA。由于其自身沒有著絲粒，因此在細(xì)胞分裂中可隨機(jī)分配到子細(xì)胞，這一特性使ecDNA在腫瘤耐藥性方面發(fā)揮作用。而且，ecDNA也可以重新整合到染色體上或者形成重復(fù)序列（HSRs）。此外，ecDNA相比于染色體DNA有更加松散的結(jié)構(gòu)，更適于其攜帶的致癌基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。ecDNA存在于正常染色體之外，其在細(xì)胞核中的空間組織目前還不清楚。但值得注意的是，ecDNA在某些生物學(xué)過程之后會(huì)發(fā)生聚集。本文中作者展示了由10-100個(gè)ecDNA聚集組成的ecDNA簇，它們聚集在間期細(xì)胞核內(nèi)，驅(qū)動(dòng)分子間增強(qiáng)子的重排從而驅(qū)動(dòng)致癌基因表達(dá)。本研究中，通過檢測(cè)在MYC-PVT1融合基因的ecDNA空間、表觀和轉(zhuǎn)錄水平的動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)ecDNA hubs作為一個(gè)組合的增強(qiáng)子集合體，對(duì)致癌基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮調(diào)控。 （1）ecDNA hubs是癌基因轉(zhuǎn)錄的主要位點(diǎn)
為了了解ecDNA在轉(zhuǎn)錄過程中的空間背景，作者使用DNA熒光原位雜交技術(shù)（FISH）分別在前列腺癌（PC3）、結(jié)直腸癌（COLO320-DM）、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（HK359）以及胃癌（SNU16）中可視化了ecDNA在間期期間在細(xì)胞核中的定位，發(fā)現(xiàn)這些ecDNA是幾十到幾百個(gè)聚集在間期細(xì)胞的細(xì)胞核的特定區(qū)域，這表明ecDNA 相互之間具有很強(qiáng)的聚集性，稱之為ecDNA hubs。為了評(píng)估ecDNA hubs的轉(zhuǎn)錄活性，作者結(jié)合了DNA和新生RNA利用FISH檢測(cè)了在PC3和COLO320-DM細(xì)胞系中MYC等位基因的轉(zhuǎn)錄活性，發(fā)現(xiàn)ecDNA  hubs上致癌基因的轉(zhuǎn)錄的概率明顯高于染色體位點(diǎn)，且發(fā)現(xiàn)MYC轉(zhuǎn)錄概率與ecDNA聚類之間有顯著的相關(guān)性。因此，當(dāng)更多的ecDNA在同一細(xì)胞聚集時(shí)，ecDNA hubs更有可能轉(zhuǎn)錄癌基因。 （2）單細(xì)胞水平識(shí)別與強(qiáng)效癌基因表達(dá)相關(guān)的ecDNA增強(qiáng)子
為了了解ecDNA上致癌基因表達(dá)的調(diào)控，作者在單細(xì)胞水平上鑒定了與癌基因高表達(dá)相關(guān)的ecDNA上的調(diào)控元件并檢測(cè)了癌細(xì)胞的異質(zhì)性，以及ecDNA與癌基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)系。作者采用單細(xì)胞組學(xué)的方法，使用ATAC- seq和RNA-seq共檢測(cè)到結(jié)直腸癌細(xì)胞系col320 -DM和COLO320-HSR中72049個(gè)細(xì)胞獲得的轉(zhuǎn)錄組和染色質(zhì)開放性圖譜。進(jìn)一步整合了每個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組和染色質(zhì)開放性圖譜，發(fā)現(xiàn)MYC的開放性隨RNA表達(dá)而增加。MYC在COLO320-DM中的表達(dá)與開放性相比于COLO320-HSR是高度異質(zhì)的。這些結(jié)果表明，調(diào)控元件可以影響ecDNA在癌基因表達(dá)中的細(xì)胞間差異。為了鑒定細(xì)胞中表達(dá)高水平MYC的ecDNA上的活性調(diào)控元件，ATAC-seq比較表明，高M(jìn)YC表達(dá)的COLO320-DM細(xì)胞既包含更高的ecDNA拷貝數(shù)，也包含更多的調(diào)控元件，在ecDNA上的差異峰分析鑒定出47個(gè)與MYC高表達(dá)密切相關(guān)的調(diào)控元件，而在染色體HSRs上鑒定出5個(gè)調(diào)控元件，這些結(jié)果表明，MYC 轉(zhuǎn)錄的增加與ecDNA中許多調(diào)節(jié)元件有關(guān)�？傊�，這些結(jié)果表明，細(xì)胞間增強(qiáng)子的差異可能是ecDNA 癌基因表達(dá)異質(zhì)性的關(guān)鍵。 （3）增強(qiáng)子和啟動(dòng)子之間的分子間互作促進(jìn)ecDNA 的異質(zhì)化和致癌基因的表達(dá)
由于發(fā)現(xiàn)(i)細(xì)胞核內(nèi)的ecDNA hubs與活躍的癌基因表達(dá)相關(guān)，(ii) ecDNA的癌基因表達(dá)與差異調(diào)節(jié)元件相關(guān)，作者下一步研究這些差異元件是否參與不同的ecDNA分子之間的增強(qiáng)子-啟動(dòng)子相互作用。作者整合了WGS、單分子DNA測(cè)序和3D 增強(qiáng)子連接體圖譜，分析ecDNA  hubs對(duì)致癌基因表達(dá)的調(diào)控。先根據(jù)之前的WGS的數(shù)據(jù)，檢測(cè)COLO320-DM細(xì)胞中ecDNA在MYC位點(diǎn)有重排，確定了PVT1能和MYC的外顯子2和3發(fā)生融合，并采用nanopore三代單分子測(cè)序的方法進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果顯示ecDNA分子在COLO320-DM中存在高度的異質(zhì)性。隨后采用HiChIP檢測(cè)了COLO320-DM和COLO320-HSR中H3K27ac與激活型增強(qiáng)子和ecDNA的作用，發(fā)現(xiàn)在ecDNA的拷貝數(shù)高的COLO320-DM中H3K27ac與激活型增強(qiáng)子結(jié)合越緊密。此外，通過ATAC-seq鑒定了大量的激活型增強(qiáng)子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與MYC基因有相互作用。綜上結(jié)果，作者認(rèn)為增強(qiáng)子和啟動(dòng)子之間的互作促進(jìn)ecDNA的異質(zhì)化和致癌基因的表達(dá)。 （4）BRD4連接ecDNA hubs并驅(qū)動(dòng)癌基因轉(zhuǎn)錄
廣泛的遠(yuǎn)距離接觸和H3K27ac相關(guān)的DNA接觸提高了BET蛋白可能參與ecDNA hubs轉(zhuǎn)錄的可能性。BET是染色質(zhì)閱讀蛋白，為了檢測(cè)BET蛋白在ecDNA促進(jìn)轉(zhuǎn)錄作用，檢測(cè)在兩種細(xì)胞中MYC位點(diǎn)BRD4的定位情況。根據(jù)H2K27ac，BRD4的ChIP-seq結(jié)果和ATAC-seq數(shù)據(jù)，表明H3K27ac 存在的激活的ecDNA增強(qiáng)子，與BRD4同時(shí)存在，BRD4連接ecDNA hubs，促進(jìn)致癌基因的轉(zhuǎn)錄。為了評(píng)估BET抑制劑JQ1在ecDNA hubs的功能中作用，作者進(jìn)行了JQ1處理，發(fā)現(xiàn)加入JQ1后ecDNA出現(xiàn)分散，且具有細(xì)胞特異性。而加入RNA PolII抑制劑，降低MYC的轉(zhuǎn)錄但不影響ecDNA hubs的聚集。通過新生RNA和DNA FISH和BRD4的ChIP-seq結(jié)果表明ecDNA hubs的形成依賴于BET蛋白，而ecDNA hubs的破壞會(huì)引起MYC致癌基因轉(zhuǎn)錄的抑制和ecDNA癌細(xì)胞的死亡。除了BET的抑制劑會(huì)抑制ecDNA的轉(zhuǎn)錄，作者還發(fā)現(xiàn)CRISPR的干擾劑，也可以抑制PVT1的啟動(dòng)子，降低PVT1-MYC的轉(zhuǎn)錄從而降低總的MYC的RNA水平。這一結(jié)果顯示ecDNA可能是調(diào)控致癌基因表達(dá)的一個(gè)更有效的思路。
（5）EcDNA hubs調(diào)控兩個(gè)癌基因位點(diǎn)的分子互作
上述研究證明ecDNA hubs可能促進(jìn)分子間增強(qiáng)子-啟動(dòng)子相互作用。為了驗(yàn)證這些相互作用，作者對(duì)人類胃癌細(xì)胞系中兩種類型的ecDNA進(jìn)行了研究，一種ecDNA包含來自8號(hào)染色體的MYC擴(kuò)增子，另一種包含來自10號(hào)染色體的FGFR2擴(kuò)增子。用FISH分析表明，MYC和FGFR2 ecDNA在間期中心區(qū)共表達(dá)。后續(xù)作者在細(xì)胞上使用H3K27ac HiChIP來檢測(cè)增強(qiáng)子-啟動(dòng)子的相互作用。這些結(jié)果說明分子間的相互作用對(duì)于致癌基因的表達(dá)非常重要。 本文研究發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞中攜帶癌基因的ecDNA成簇出現(xiàn)，形成ecDNA hubs。這種ecDNA hubs促進(jìn)了新的增強(qiáng)子-啟動(dòng)子相互作用和癌基因表達(dá)。反過來，這些增強(qiáng)子在癌基因間的不同導(dǎo)致細(xì)胞間的異質(zhì)性。此外，ecDNA hubs可能還涉及不同ecDNA分子上的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件,這些轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件也可能調(diào)控遠(yuǎn)距離的基因表達(dá)。這一發(fā)現(xiàn)在ecDNA上的癌基因調(diào)控如何有助于致癌基因轉(zhuǎn)錄和癌細(xì)胞的異質(zhì)性上有重要意義。

云序生物eccDNA測(cè)序
eccDNA測(cè)序（別名：Circle-Seq﹑環(huán)狀DNA測(cè)序）是eccDNA檢測(cè)利器，可以高通量地對(duì)檢測(cè)樣品中的所有eccDNA，具有檢出率高﹑準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)。云序生物eccDNA測(cè)序采用多種方法高效地富集和擴(kuò)增eccDNA，簡(jiǎn)述如下：首先，利用A&A Biotechnology離子交換柱（云序生物是A&A Biotechnology品牌全線產(chǎn)品的全國(guó)總代理）高效富集基因組DNA中的eccDNA，然后利用核酸酶進(jìn)一步對(duì)富集的eccDNA進(jìn)行消化除去殘余線性DNA。富集純化后，通過滾環(huán)擴(kuò)增獲得大量的eccDNA拷貝,再利用NGS測(cè)序高通量地檢測(cè)樣品中所有的環(huán)狀DNA分子。嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)流程，極大地提高了eccDNA的檢出率和檢測(cè)靈敏度。最后，通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膃ccDNA生信流程，實(shí)現(xiàn)了對(duì)eccDNA準(zhǔn)確的識(shí)別和詳細(xì)的基因注釋,快速找到癌癥、腫瘤等疾病機(jī)理研究和診斷的靶向eccDNA。       
云序生物eccDNA測(cè)序優(yōu)勢(shì)
1.國(guó)內(nèi)首推eccDNA測(cè)序服務(wù)
云序生物是國(guó)內(nèi)最早提供eccDNA測(cè)序服務(wù)的公司，云序在2018年已啟動(dòng)了eccDNA測(cè)序技術(shù)的開發(fā)。迄今為止，我們已經(jīng)完成上千例樣品的eccDNA測(cè)序，積累了豐富的項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)，樣品類型涵蓋：組織﹑細(xì)胞﹑血清﹑血漿﹑尿液等，物種涵蓋：人﹑小鼠﹑大鼠﹑擬南芥﹑果蠅﹑酵母﹑非洲爪蟾等。 √ 云序產(chǎn)品1：eccDNA測(cè)序
作用：通過NGS測(cè)序高通量地檢測(cè)和識(shí)別樣品中的所有eccDNA。
√ 云序產(chǎn)品2：eccDNA Outward PCR驗(yàn)證
作用：通過核酸外切酶處理和Outward PCR驗(yàn)證eccDNA的環(huán)形結(jié)構(gòu)。 √ 云序產(chǎn)品3：eccDNA Sanger測(cè)序
作用：通過金標(biāo)準(zhǔn)的Sanger測(cè)序，驗(yàn)證eccDNA特異性的junction位點(diǎn)。
3.專業(yè)的生信分析
云序生物對(duì)eccDNA進(jìn)行專業(yè)細(xì)致的注釋，提供eccDNA的染色體信息﹑坐標(biāo)信息﹑長(zhǎng)度信息﹑反式剪切位點(diǎn)信息﹑序列信息﹑對(duì)應(yīng)的基因信息﹑基因的GO條目及KEGG信號(hào)通路注釋信息等，為后續(xù)的研究提供了重要線索和便利。
云序eccDNA生信示例：

1）eccDNA表達(dá)和差異分析

2）eccDNA整體統(tǒng)計(jì)

 

3）eccDNA功能預(yù)測(cè)

高質(zhì)量的數(shù)據(jù)
云序生物嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)流程和專業(yè)的數(shù)據(jù)分析保證了高質(zhì)量的結(jié)果，eccDNA測(cè)序數(shù)據(jù)與Sanger驗(yàn)證結(jié)果完美吻合，實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)示例如下：

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