miRNAs是一類長約22nt的單鏈小RNA，已經(jīng)成為多種疾病的關(guān)鍵調(diào)控分子。大量研究表明miRNA參與調(diào)節(jié)生物體內(nèi)分子過程以及各種疾病的發(fā)生過程，但針對m6A甲基化修飾是否會對miRNA調(diào)節(jié)疾病相關(guān)過程產(chǎn)生影響的研究卻微乎其微。為了解答這一問題，云序客戶通過高通量測序以及多種分子機制研究手段對m6A影響miRNA分子機制的研究進(jìn)行了揭示，并且在oncogene上發(fā)表了相應(yīng)的研究成果（Deoxycholic acid modulates the progression of gallbladder cancer through N6-methyladenosine-dependent microRNA maturation），本文結(jié)合本文結(jié)合meRIP, miRNA-seq,qPCR等多種技術(shù)，揭示了脫氧膽酸可能在膽囊癌中發(fā)揮作用，為膽囊癌提供了一種新的診治策略。
發(fā)表期刊：Oncogene
影響因子：7.971
實驗方法:  miRNA-seq ，m6A-meRIP-qPCR，雙熒光素酶實驗
文章鏈接：Deoxycholic acid modulates the progression of gallbladder cancer through N6-methyladenosine-dependent microRNA maturation

研究內(nèi)容
(1)  人GBC標(biāo)本中血清DCA水平分析
越來越多的證據(jù)表明，BA穩(wěn)態(tài)的失衡是疾病的主要特征，因此作者對正常人和GBC患者的血清進(jìn)行BAs檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常個體不同，GBC患者中大多數(shù)血清BA水平明顯升高(圖1a)，這表明BAs穩(wěn)態(tài)被明顯破壞，并可能影響疾病的發(fā)生和進(jìn)展。與之相反，DCA（一種繼發(fā)性游離性BA）被發(fā)現(xiàn)在GBC患者中明顯降低。此外，與GBC相比，膽囊腺瘤(GA)是一種侵襲性較弱的膽囊疾病，其血清中DCA水平較高(圖1b)，表明DCA下調(diào)水平依賴于癌癥表型。這些發(fā)現(xiàn)顯示DCA可能是一種新的GBC診斷生物標(biāo)志物。
為了探討使用血清DCA作為GBC患者診斷生物標(biāo)志物的可能性，作者評估了受試者工作特征(ROC)曲線。作者發(fā)現(xiàn)血清DCA水平的ROC曲線下面積為0.87，高于CA19-9（常規(guī)診斷生物標(biāo)志物）的ROC曲線0.71。此外，血清DCA水平越低，GBC越具有侵襲性，表現(xiàn)為腫瘤塊更大且Ki-67表達(dá)更強(圖1d, e)。因此，血清DCA水平可能是GBC的潛在診斷生物標(biāo)志物。
并且，DCA水平下降的GBC患者總體生存率較差。此外，單因素回歸分析顯示，GBC患者的肝臟侵襲性、腫瘤大小、TNM分期、遠(yuǎn)程轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、T分類和血清DCA水平均與生存期密切相關(guān)(圖1g)。多因素回歸分析顯示DCA可作為GBC患者預(yù)后診斷分子標(biāo)志物。綜上研究結(jié)果顯示，DCA在GBC患者中表達(dá)下調(diào)，且與不良臨床結(jié)果相關(guān)，可將DCA確定為GBC的潛在生物標(biāo)志物。
 
(2) DCA在GBC細(xì)胞中具有抑瘤作用

近期研究表明，BAs在某些腫瘤中積累可減緩腫瘤增殖說明BAs可能具有抑癌作用。由于膽囊BAs與血清BAs密切相關(guān)，作者測定了DCA在膽囊的濃度范圍。然后，作者測定了三種人GBC細(xì)胞株中DCA濃度范圍在nM到 μM范圍內(nèi)的細(xì)胞存活率，發(fā)現(xiàn)三種GBC細(xì)胞的細(xì)胞活力在μM范圍內(nèi)均受到影響。為確定DCA是否對GBC發(fā)展產(chǎn)生影響，作者在體外通過不同濃度的DCA對NOZ和GBC- SD兩種人GBC細(xì)胞系的生物學(xué)行為進(jìn)行了評估。DCA處理明顯降低GBC細(xì)胞活力，且呈劑量依賴性(圖2a)。接下來，作者研究了DCA是否影響GBC細(xì)胞的增殖。增殖實驗結(jié)果顯示，DCA處理明顯減少NOZ和GBC- SD細(xì)胞的增殖(圖2b)，說明DCA可能減緩GBC腫瘤細(xì)胞的生長。集落形成試驗表明，DCA處理后，NOZ和GBC-SD細(xì)胞的集落數(shù)量明顯減少(圖2c)。作者進(jìn)一步研究了DCA對裸鼠GBC移植瘤生長的影響。通過皮下注射GBC癌細(xì)胞給小鼠，然后喂食含有0.1% DCA的飲食或等量的載體。與對照組(vehicle)相比，DCA治療組腫瘤生長速率(圖2d, e)和腫瘤重量(圖2f)均明顯降低。此外，Ki-67免疫染色對來自不同小鼠的腫瘤的組織病理學(xué)分析顯示，DCA治療組的增殖率低于對照組(圖2 g)。綜上所述，體內(nèi)外實驗結(jié)果表明，DCA對GBC具有抑瘤作用。
 

(3) DCA降低GBC細(xì)胞中miR-92b-3p的表達(dá)
作為一種非編碼RNA，miRNAs已經(jīng)成為癌癥的關(guān)鍵調(diào)控分子。作者進(jìn)行了高通量miRNA-seq檢測，發(fā)現(xiàn)DCA處理的NOZ細(xì)胞中有26個miRNA的表達(dá)與vehicle處理的相比存在明顯差異。分析結(jié)果顯示，在DCA處理后，17個miRNA下調(diào)，更小的miRNA被上調(diào)(圖3a)。對上述處理的NOZ和GBC-SD細(xì)胞進(jìn)行PCR (qPCR)分析顯示在下調(diào)的miRNA中，下調(diào)較明顯的是miR-92-3p 。此外，GBC細(xì)胞中miR-92b-3p的表達(dá)也受DCA劑量依賴性的減少(圖3c)。為了進(jìn)一步探究miR-92b-3p在GBC細(xì)胞中的作用，作者建立了穩(wěn)定過表達(dá)miR-92b-3p的NOZ和GBC- SD細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)miR-92b-3p明顯增強了細(xì)胞的增殖。miR-92b-3p的異位表達(dá)部分減弱了DCA介導(dǎo)的腫瘤生長減緩。此外，作者也分析了miR-92b-3p在手術(shù)切除旁組織和GBC組織標(biāo)本中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miR-92b-3p在組織中的表達(dá)高于旁組織。這些結(jié)果顯示miR-92b-3p可能參與了疾病進(jìn)展的不同階段，并可能導(dǎo)致較差的臨床結(jié)果。
為了驗證該項假設(shè)，作者通過數(shù)據(jù)庫研究miR-92b-3p的表達(dá)是否與GBC的預(yù)后密切相關(guān)。然而，在TCGA中沒有發(fā)現(xiàn)miRNA表達(dá)與GBC存活時間的關(guān)系，可能是由于樣本量小。但作者也發(fā)現(xiàn)，miR-92b-3p的高表達(dá)與較短的生存時間明顯相關(guān)。因此，作者測量了miR-92b-3p在GBC組織樣本中的表達(dá)，結(jié)果顯示過表達(dá)miR-92b-3p的GBC患者總生存時間較低表達(dá)miR-92b-3p的患者短。這些數(shù)據(jù)表明，miR-92b-3p是GBC的一種新的致癌因子，DCA可能通過控制GBC細(xì)胞中miR-92b-3p的表達(dá)而發(fā)揮減少因子的作用。 
(4) MiR-92b-3p作用于PTEN降低PI3K/AKT信號
為了探究潛在的miR-92b-3p靶基因，維恩圖結(jié)果顯示磷酸酶和緊張素同源基因(PTEN)可能是潛在的候選基因。為了進(jìn)一步驗證，作者使用含有miR-92b-3p 的PTEN 3’-UTR片段的載體進(jìn)行了雙熒光素酶實驗。與對照組相比，miR-92b-3p對含有PTEN 3’-UTR的載體的熒光素酶活性表現(xiàn)出劑量依賴性減少NOZ和GBC-SD細(xì)胞。然而，在含有突變PTEN 3’-UTR的載體中，miR -92b-3p結(jié)合位點發(fā)生突變，熒光素酶報告基因的活性未受影響。此外，在NOZ和GBC-SD細(xì)胞中，過表達(dá)miR-92b-3p會降低PTEN mRNA水平，而敲除miR-92b-3p則會提高PTEN mRNA水平。作者使用AGO2的抗體進(jìn)行了RNA免疫沉淀(RIP)，然后進(jìn)行qRT-PCR，發(fā)現(xiàn)miR-92b-3p和過表達(dá)miR-92b-3p的NOZ細(xì)胞和GBC-SD細(xì)胞的miRNA-RISC復(fù)合物中，PTEN mRNA富集。綜上所述，這些結(jié)果表明PTEN是miR-92b-3p靶向基因。
為了進(jìn)一步確定miR-92b-3p在GBC細(xì)胞中的生物學(xué)作用，作者使用NOZ細(xì)胞敲低了miR-92b-3p進(jìn)行了整體RNA表達(dá)分析。PI3K/AKT通路在基因集富集分析圖中富集。接下來，通過免疫印跡法測定miR-92b-3p對PI3K/AKT信號通路的影響。敲低miR-92b-3p后p-AKT (Ser473)、p-70S6K (Thr389)和p-eIF4EBP1(phospho T37)的蛋白水平明顯降低，而在NOZ和GBC-SD細(xì)胞中過表達(dá)miR-92b-3p則明顯升高。這些數(shù)據(jù)表明，miR-92b-3p通過減少PTEN的表達(dá)，作為PI3K/AKT信號的上游因子。此外，DCA處理GBC細(xì)胞后下調(diào)了miR-92b-3p的表達(dá)，PTEN mRNA和蛋白水平明顯升高。與上述研究結(jié)果一致，DCA處理明顯降低了NOZ和GBC-SD細(xì)胞的PI3K/AKT信號通路。綜上所述，這些結(jié)果表明，在膽囊癌中，miR-92b-3p下調(diào)可通過上調(diào)PTEN來減少致癌PI3K/AKT信號。
(5) 特定位點的m6A修飾與pri-miR-92b的DCA轉(zhuǎn)錄降低相關(guān)
有報道稱甲基化會影響miRNA成熟，因此研究DCA處理是否會改變pri-miR-92b的甲基化水平也十分關(guān)鍵。首先，作者通過對pri-miR-92b序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了一個m6A位點。隨后通過使用meRIP-qPCR研究了DCA處理是否介導(dǎo)了GBC細(xì)胞中pri-miR-92b的m6A水平。后續(xù)qRT-PCR結(jié)果顯示在處理后的細(xì)胞中，pri-miR-92b的m6A水平明顯降低。此外，下調(diào)METTL3消除了DCA處理介導(dǎo)的pri-miR-92b m6A甲基化的改變，揭示了DCA介導(dǎo)的pri-miR-92b的甲基化主要依賴于METTL3。接下來，作者評估了pri-miR-92b、pre-miR-92b和miR-92b-3p在NOZ和GBC-SD細(xì)胞中表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)，DCA處理的細(xì)胞中pri-miR-92b的水平明顯高于對照組細(xì)胞；相反，DCA處理后，pre-mir-92b和miR-92b-3p水平降低。為了驗證甲基化調(diào)節(jié)miR-92b-3p的成熟，作者進(jìn)行了體外RNA處理實驗。在體外，pri-miR-92b與過表達(dá)miRNA加工酶DROSHA和DGCR8的HEK293T細(xì)胞共孵育。與未甲基化的對應(yīng)物相比甲基化修飾的pri-miR-92b轉(zhuǎn)化為pre-miR-92b和miR-92b-3p的效率更高。符合pri-miR-92b的成熟與甲基化相關(guān)的推測，當(dāng)pri-miR-92b中的METTL3-催化基序突變時，pri-miR-92b向成熟形態(tài)的轉(zhuǎn)化速度明顯降低。因為miR-92b-3p影響GBC細(xì)胞系的增殖，pri-miR-92b的甲基化可能與GBC的進(jìn)展密切相關(guān)。接下來，meRIP-qPCR檢測在GBC組織和鄰近正常組織樣本中pri-miR-92b的甲基化水平。結(jié)果顯示，GBC組織中pri-miR-92b的甲基化程度明顯高于鄰近的正常組織標(biāo)本。綜上所述，這些體外和體內(nèi)結(jié)果證明了DCA通過引起在GBC細(xì)胞中的甲基化位點特異性m6A的減少而減緩miR-92b-3p的成熟。

(6) DCA通過與METTL3結(jié)合來破壞METTL3 -METTL14- WTAP復(fù)合物
然后作者研究了DCA調(diào)節(jié)pri-miR-92b的m6A修飾分子機制。越來越多的證據(jù)表明METTL3-METTL14-WTAP復(fù)合物在在哺乳動物核RNA的m6A沉積中起著關(guān)鍵作用，因此作者研究了DCA對這三個基因表達(dá)的影響。然而，包括METTL3在內(nèi)的這些基因的mRNA和蛋白質(zhì)水平?jīng)]有變化，DCA處理GBC細(xì)胞時，觀察到METTL14和WTAP，說明DCA可能是通過破壞METTL3-METTL14-WTAP復(fù)合物發(fā)揮作用。作者認(rèn)為DCA可以直接綁定到一個組件上從而干擾復(fù)合物的形成。為了證實這一點，作者進(jìn)行了兩種生化分析。通過藥物親和反應(yīng)靶穩(wěn)定性(DARTS)檢測，發(fā)現(xiàn)METTL3蛋白與DCA在體外直接結(jié)合，在NOZ和GBC-SD細(xì)胞中均以劑量依賴的方式通過蛋白酶減少其降解。為了進(jìn)一步驗證這一假設(shè)，作者進(jìn)行了免疫共沉淀實驗。如預(yù)期的那樣，在沒有DCA處理下METTL3與METTL14和WTAP形成絡(luò)合物；相反，DCA處理后觀察到METTL3與METTL14和WTAP不能形成復(fù)合物。這些結(jié)果支持了DCA通過與METTL3結(jié)合破壞METTL3-METTL14-WTAP復(fù)合物從而導(dǎo)致pri-mir-92 b甲基化水平下降從而影響miR-92b-3p成熟。
(7) DCA通過下調(diào)miR-92b-3p表達(dá)減緩GBC生長
為了進(jìn)一步探究miR-92b-3p在GBC中的關(guān)鍵作用，作者在裸鼠皮下接種了體外表達(dá)的miR-92b-3p或空載的NOZ細(xì)胞，然后給裸鼠喂食含有DCA的食物或等量的載體。與空載體相比，過表達(dá)miR-92b-3p提高了細(xì)胞的增殖能力，而DCA處理可以提高細(xì)胞的增殖能力明顯減弱miR-92b-3p介導(dǎo)的腫瘤生長。同樣，免疫組化法測定Ki-67、p-AKT (Ser473)、p-70S6K (Thr389)和peIF4EBP1 (phospho T37)發(fā)現(xiàn)在DCA處理后增殖率明顯降低，AKT信號通路水平明顯降低；在GBC中，miR-92b-3p過表達(dá)通過靶向PTEN部分挽救了DCA誘導(dǎo)的生長減緩。接下來，作者評估了血清DCA水平與GBC組織標(biāo)本中miR-92b-3p水平的相關(guān)性。結(jié)果顯示，血清DCA水平與GBC組織標(biāo)本中miR-92b-3p水平呈負(fù)相關(guān)�？紤]到miR-92b-3p靶向PTEN降低AKT信號通路，作者測量了GBC組織樣本中PTEN、p-AKT (Ser473)、p-70S6K (Thr389)和p-eIF4EBP1 (phospho T37)蛋白水平。發(fā)現(xiàn)除PTEN外，其余蛋白均與GBC中DCA水平呈負(fù)相關(guān)，而GBC中DCA水平較低。綜上所述，這些結(jié)果表明，在GBC組織中存在DCA-miR-92b-3p-PTEN-PI3K/AKT調(diào)控軸，這可能為GBC提供了一種新的診治策略。 
云序生物m6A修飾研究五大模塊
01 m6A RNA修飾測序
m6A RNA修飾測序（m6A-seq）
對m6A RNA甲基化，目前流行的檢測手段為m6A-Seq技術(shù)，適用于m6A RNA甲基化譜研究，快速篩選m6A RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多種非編碼RNA的m6A測序：
√ m6A 全轉(zhuǎn)錄組測序（涵蓋mRNA，LncRNA，circRNA）
√ m6A  LncRNA測序（涵蓋LncRNA和mRNA）
√ m6A  Pri-miRNA測序（涵蓋Pri-miRNA和mRNA）
√ m6A  mRNA測序
√ m6A  miRNA測序
02 檢測整體m6A RNA修飾水平
 LC-MS/MS檢測整體RNA修飾水平
準(zhǔn)確高效，可以實現(xiàn)一次檢測，9類修飾水平檢測，一步到位。
比色法
快速檢測m6A整體甲基化水平
03 m6A RNA修飾上游酶的篩選
m6A RNA修飾相關(guān)酶PCR芯片
尋找上游直接調(diào)控m6A RNA甲基化的甲基轉(zhuǎn)移酶。
04 m6A RNA修飾靶基因驗證
meRIP-qPCR
云序提供各類不同修飾的meRIP-qPCR服務(wù)，可針對mRNA，lncRNA，環(huán)狀RNA等不同類型的RNA分子進(jìn)行檢測，低通量驗證RNA修飾靶基因表達(dá)水平。
05機制互作研究
5.1 RIP-seq/qPCR
篩選或驗證RNA修飾直接靶點，研究RNA修飾靶基因的調(diào)控機制。
5.2 RNA pull down -MS/WB
篩選或驗證目標(biāo)RNA互作基因或蛋白，研究相應(yīng)的分子調(diào)控機制。
5.3 雙熒光素酶實驗
驗證兩基因互作，研究相應(yīng)的分子調(diào)控機制。
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