文章導(dǎo)讀
外泌體是細(xì)胞分泌的大小為30-200nm的盤狀囊泡，它在人體體液中分布廣 泛。2013年，科學(xué)家通過研究外泌體細(xì)胞囊泡調(diào)控機(jī)制獲得諾貝爾獎，這使外泌體開始被廣 泛關(guān)注，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)外泌體可作為細(xì)胞間信息交流的橋梁，在細(xì)胞間往來穿梭進(jìn)行信息傳遞。另外，外泌體與疾病的發(fā)生尤其是在腫 瘤中起到十分關(guān)鍵的作用，因此，外泌體也成為了研究疾病以及靶向治 療的切入點。
盡管外泌體的研究十分火熱，但前期研究主要集中在外泌體的信息傳遞以及外泌體中microRNA的作用機(jī)制等方面，關(guān)于外泌體中環(huán)狀RNA的研究仍方興未艾，今 天小編就近日新發(fā)表的三篇外泌體環(huán)狀RNA高 分文章進(jìn)行解析，希望能夠使大家對外泌體中的環(huán)狀RNA的研究有一些新的認(rèn)識。

文章展示
1.肝ai細(xì)胞來源的外泌體circUHRF誘導(dǎo)自然殺傷細(xì)胞的衰竭，影響抗PD1治 療的耐藥性
發(fā)表期刊：Molecular Cancer
影響因子：15.302
發(fā)表時間：2020.6.27
文章鏈接：Cancer cell-derived exosomal circUHRF1 induces natural killer cell exhaustion and may cause resistance to anti-PD1 therapy in hepatocellular carcinoma
2020年6月27日，Molecular Cancer（IF=15.302）雜志上發(fā)表了一篇題為“Cancer cell-derived exosomal circUHRF1 induces natural killer cell exhaustion and may cause resistance to anti-PD1 therapy in hepatocellular carcinoma”的文章，文中對肝ai（HCC）細(xì)胞分泌的外泌體中circUHRF1的研究發(fā)現(xiàn)，circUHRF1可以通過與miR-449c-5p形成海綿機(jī)制從而影響其下游基因TIM-3的表達(dá)，結(jié)果顯 示抑 制自然殺傷細(xì)胞（NK）功能并提高了抗PD1免疫療法的耐藥性。
（1）circUHRF1在肝ai組織中表達(dá)上調(diào)
通過環(huán)狀RNA測序數(shù)據(jù)分析得到UHRF1在肝ai組織中表達(dá)上調(diào)，并在其病理過程中起重要作用。后通過qPCR技術(shù)檢測HCC中的標(biāo)志基因UHRF1來源的14個circRNA，發(fā)現(xiàn)hsa_cic_0048677(circUHRF1)是肝ai組織中表達(dá)量第 一高的環(huán)狀RNA。并且在HCC組織中circUHRF1的表達(dá)高于非腫 瘤組織。臨床生理表型顯示circUHRF1表達(dá)高的患者中腫 瘤體積較大，血液中NK細(xì)胞比例較低，微血管浸潤較多。Kaplan-Meier生存分析顯示，circUHRF1高表達(dá)患者伴隨臨床預(yù)后不良。綜上所述，HCC細(xì)胞中circUHRF1表達(dá)上調(diào)與患者預(yù)后不良相關(guān)，并表明circUHRF1表達(dá)上調(diào)可能參與了HCC的進(jìn)展。

 

（2）肝ai細(xì)胞可以通過外泌體分泌circUHRF1
作者從六種肝ai細(xì)胞系中分離并利用電鏡（TEM）和WB鑒定了相應(yīng)的外泌體。qPCR顯示HCCLM3和SMMC-7721細(xì)胞系衍生的外泌體circUHRF1的表達(dá)第 一高。為了研究circUHRF1是否可以由HCC細(xì)胞通過外泌體遞送到HCC患者血漿中。進(jìn)行了qPCR鑒定了血漿外泌體circUHRF1，結(jié)果顯示HCC患者血漿外泌體circUHRF1水平較高，腫 瘤切除后血漿外泌體circUHRF1水平降低，腫 瘤復(fù)發(fā)患者血漿外泌體circUHRF1水平升高，說明血漿外泌體circUHRF1主要由HCC細(xì)胞產(chǎn)生。此外，外泌體circUHRF1水平的升高常伴隨著NK細(xì)胞比例降低。上述數(shù)據(jù)表明，外泌體circUHRF1可能是決定NK細(xì)胞相關(guān)免疫逃避的關(guān)鍵分子。 （ 3）肝ai細(xì)胞通過外泌體circUHRF1抑 制NK細(xì)胞功能
為確定HCC細(xì)胞衍生的外泌體circUHRF1是否可以誘導(dǎo)NK細(xì)胞功能異常，作者將NK細(xì)胞與HCCLM3和SMMC-7721細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)。結(jié)果表明，與SMMC-7721和HCCLM3細(xì)胞共培養(yǎng)的NK細(xì)胞中分泌IFN-γ和TNF-α受到抑 制且circUHRF1表達(dá)的顯 著增強，但這兩種作用可以被外泌體抑 制劑GW4869所阻斷。為進(jìn)一步研究HCC細(xì)胞是通過外泌體circUHRF1介導(dǎo)NK細(xì)胞功能障礙，作者利用shRNA敲低了SMMC-7721和HCCLM3 細(xì)胞中circUHRF1的表達(dá)，qPCR顯示在敲低circUHRF1的肝ai細(xì)胞中，外泌體circUHRF1的表達(dá)顯 著降低，從而改善NK細(xì)胞中IFN-γ和TNF-α的分泌受損。這些結(jié)果說明，HCC通過外泌體circUHRF1抑 制NK細(xì)胞功能。 （4）circUHRF1通過miR-449c-5p相關(guān)途徑來抑 制NK細(xì)胞功能
作者利用生物信息學(xué)預(yù)測了14個miRNA，在NK-92細(xì)胞中進(jìn)行circUHRF1-RIP以及qPCR，結(jié)果表明miR-449c-5p是NK-92細(xì)胞中一個與circUHRF1相互作用的miRNA。在NK-92細(xì)胞中進(jìn)行抗AGO2抗體的RIP和生物素化miR-449c-5p的RNA pull-down實驗，證明了circUHRF1可以直接與miR-449c-5p結(jié)合。此外經(jīng)雙熒光素酶報告實驗和分別在NK-92細(xì)胞中過表達(dá)circUHRF1和miR-449c-5p，證明了在NK細(xì)胞中circUHRF1和miR-449c-5p可能相互靶向。此外單獨過表達(dá)miR-449c-5p會顯 著抑 制腫 瘤的活性，但增加circUHRF1表達(dá)顯 著抑 制miR-449c-5p的腫 瘤抑 制功能，說明HCC衍生的外泌體circUHRF1通過miR -449c-5p相關(guān)途徑抑 制NK細(xì)胞功能。 作者分析了NK細(xì)胞中預(yù)測的miR-449c-5p靶基因TIM-3，同樣進(jìn)行了雙熒光素酶報告實驗，結(jié)果顯示miR-449c-5p能直接與靶基因TIM-3的3’UTR區(qū)直接結(jié)合。超表達(dá)miR-449c-5p后TIM-3表達(dá)顯 著降低。為了驗證NK細(xì)胞中外泌體circUHRF1的持續(xù)上調(diào)吸附miR-449c-5p，從而導(dǎo)致TIM-3的表達(dá)上調(diào)造成HCC的免疫逃避這一觀點。作者檢測了miR-449c-5p單獨或與circUHRF1共同轉(zhuǎn)染的NK-92細(xì)胞中TIM-3的表達(dá)。結(jié)果顯示，miR-449c-5p超表達(dá)導(dǎo)致TIM-3 mRNA和蛋白表達(dá)水平下降，而circUHRF1逆轉(zhuǎn)了miR-449c-5p的抑 制作用。在體內(nèi)同樣證實了circUHRF1通過調(diào)控miR-449c-5p/TIM-3軸來阻礙NK細(xì)胞的功能。 （6）circUHRF1以NK細(xì)胞依賴性方式促進(jìn)HCC進(jìn)展
為了進(jìn)一步探討circUHRF1在HCC中的作用，使用pLO5-ciR-circUHRF1上調(diào)了PLC / PRF / 5細(xì)胞中circUHRF1的表達(dá)。qPCR結(jié)果顯示，在過表達(dá)circUHRF1的HCC細(xì)胞中，外泌體circUHRF1水平也顯 著上調(diào)。此外，使用PLC/PRF/5細(xì)胞構(gòu)建肺轉(zhuǎn)移的NOD/SCID小鼠模型(注射來自健康供者的NK細(xì)胞)。結(jié)果表明，在接種過表達(dá)circUHRF1細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移小鼠內(nèi)，血漿外泌體中circUHRF1水平更高，肺部的轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)更多及結(jié)節(jié)內(nèi)NKG2D陽性細(xì)胞更少。說明，circUHRF1以外泌體和NK細(xì)胞依賴性的方式促進(jìn)HCC進(jìn)展。 （7）circUHRF1可以提高肝ai對抗PD1治 療的耐藥性
分析了30例進(jìn)行肝切除術(shù)并接受抗PD1免疫治 療的HCC患者的資料并測定circUHRF1的表達(dá)水平，結(jié)果表明，PD組的circUHRF1水平明顯高于SD組和PR組。此外，檢測了30例HCC患者組織中NKG2D的表達(dá)水平。結(jié)果表明，與抗PD1治 療敏感的HCC患者相比，抗PD1治 療耐藥的HCC患者中NKG2D的陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少。為直接評估circUHRF1對抗PD1治 療的影響，通過皮下植入circUHRF1基因敲低的HCCLM3細(xì)胞或相應(yīng)的陰性對照細(xì)胞來構(gòu)建小鼠移植瘤模型。結(jié)果表明，植入circUHRF1基因敲低細(xì)胞的小鼠對抗PD1治 療敏感，并伴隨總生存率的提高。根據(jù)上述研究，過表達(dá)circUHRF1可以提高HCC對抗PD1治 療的耐藥性，而靶向circUHRF1可能是恢復(fù)HCC對抗PD1治 療敏感性的有效方法。 2. 外泌體circSHKBP1通過調(diào)控miR-582-3p/HUR/VEGF過程以及抑 制HSP90降解來促進(jìn)胃ai發(fā)展
發(fā)表期刊：Molecular Cancer
影響因子：15.302
發(fā)表時間：2020.6.29
文章鏈接：Exosomal circSHKBP1 promotes gastric cancer progression via regulating the miR-582-3p/HUR/VEGF axis and suppressing HSP90 degradation
2020年6月29日，“Exosomal circSHKBP1 promotes gastric cancer progression via regulating the miR-582-3p/HUR/VEGF axis and suppressing HSP90 degradation”，文中闡述了circSHKBP1能夠在胃ai患者的腫 瘤和血清中高表達(dá)，并且可以被外泌體遞送，通過海綿吸附miR-582-3p并抑 制HSP90的降解從而起到促ai作用，為胃ai（GC）的發(fā)病機(jī)理研究提供了新的理論基礎(chǔ)。 （1）circSHKBP1在GC組織中顯 著上調(diào)
作者首先通過外泌體環(huán)狀RNA測序在8例GC組織和8例正常組織的樣本中 共鑒定出119種差異表達(dá)的circRNA。qPCR發(fā)現(xiàn)circSHKBP1是GC中差異表達(dá)很是顯 著的circRNA。設(shè)計反式剪切位點引物擴(kuò)增circSHKBP1并進(jìn)行Sanger測序和RNase R實驗，驗證表明circSHKBP1是高度穩(wěn)定的環(huán)狀RNA。對來自GC患者的152對ai組織和正常組織進(jìn)行ISH分析發(fā)現(xiàn)GC組織的circSHKBP1豐度遠(yuǎn)高于正常組織，且circSHKBP1的表達(dá)與晚期TNM分期、血管浸潤和預(yù)后不良相關(guān)。
（2）血清外泌體的circSHKBP1來源于GC組織
為了確定是否可以在血清外泌體中檢測到circSHKBP1，作者收集了20對GC組織和健康組織的血清外泌體，通過電鏡（TEM）和WB發(fā)現(xiàn)，胃ai患者血清外泌體來源的circSHKBP1比健康對照組更豐富。血清外泌體中circSHKBP1水平約為GC患者腫 瘤組織中circSHKBP1水平的6倍。研究胃切除手術(shù)前后血清外泌體的circSHKBP1水平，發(fā)現(xiàn)切除腫 瘤后外泌體circSHKBP1水平急劇下降，說明GC組織是外泌體circSHKBP1的來源。以上結(jié)果表明，circSHKBP1是一種來源于胃ai組織的circRNA，可以被外泌體有效地輸送到循環(huán)系統(tǒng)中。此外，circSHKBP1的高表達(dá)與晚期TNM分期和GC預(yù)后不良相關(guān)，使其具有作為GC潛在分子標(biāo)志物的潛力。 （3）GC來源的外泌體circSHKBP1在體外能促進(jìn)GC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲
為了探索circSHKBP1是否影響GC細(xì)胞的生物學(xué)過程，分析了circSHKBP1在4種人GC細(xì)胞系（BGC823、HGC27、AGS和MGC803）和正常胃上皮細(xì)胞系GES1中的表達(dá)水平。結(jié)果表明，circSHKBP1在4個GC細(xì)胞系中均高表達(dá)。此外，來自BGC823細(xì)胞培養(yǎng)基的外泌體circSHKBP1在GC細(xì)胞系中也存在過表達(dá)。隨后，以circSHKBP1反向剪接序列的siRNA來敲低circSHKBP1，用pcDNA3.1-CMV-circRNA載體構(gòu)建circSHKBP1過表達(dá)質(zhì)粒。CCK8和EdU檢測和Transwell檢測顯示，沉默circSHKBP1顯 著抑 制GC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力而過表達(dá)circSHKBP1則相反。此外，作者從轉(zhuǎn)染了circSHKBP1質(zhì)粒的BGC823和HGC27細(xì)胞培養(yǎng)液中提取外泌體，與未處理的GC細(xì)胞共培養(yǎng)。結(jié)果表明，外泌體circSHKBP1的過表達(dá)也影響了GC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。綜上所述，過circSHKBP1能促進(jìn)GC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲并且隨著circSHKBP1在GC細(xì)胞中的表達(dá)，更多的circSHKBP1通過外泌體中干擾其他GC細(xì)胞的生物學(xué)功能。  （4）circSHKBP1可通過海綿機(jī)制吸附miR-582-3p
鑒于circRNA海綿吸附miRNA的作用已被廣 泛研究，且circSHKBP1在胞質(zhì)中含量豐富，作者探索了circSHKBP1是否通過作為miRNA的海綿分子來發(fā)揮生物學(xué)功能。對BGC823細(xì)胞中的AGO2進(jìn)行RIP，結(jié)果顯示內(nèi)源性circSHKBP1特異性地富集于AGO2。使用CircInteractome預(yù)測可以與circSHKBP1結(jié)合的潛在miRNA分子（miR-582-3p、miR-665、miR-1207和miR-4458）。qPCR、RNA pull-down和雙熒光素酶報告實驗證實只有miR-582-3p可以直接與circSHKBP1互作。綜上所述，circSHKBP1可以充當(dāng)miR-582-3p的海綿分子并降低miR-582-3p的表達(dá)。隨后作者將miR-582-3p單獨轉(zhuǎn)染或與circSHKBP1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到GC細(xì)胞中。CCK8和Transwell分析表明，miR-582-3p會抑 制GC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，而過表達(dá)circSHKBP1則消除了它對GC細(xì)胞生長的抑 制作用，這表明circSHKBP1是通過海綿吸附miR-582-3p來發(fā)揮的促ai作用。 （5）circSHKBP1通過上調(diào)HUR來促進(jìn)VEGF的翻譯
分析臨床數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)circSHKBP1高表達(dá)組的血管浸潤率顯 著較高。使用生信分析網(wǎng)站找到了miR-582-3p的下游靶標(biāo)HUR和EIF2S1，它們是VEGF（促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖）信號通路的一部分。WB分析顯示，過表達(dá)circSHKBP1會促進(jìn)HUR和VEGF的表達(dá)，而對EIF2S1無影響。此外，miR-582-3p模擬物可以降低BGC823細(xì)胞中HUR和VEGF的表達(dá)。同樣，敲低circSHKBP1下調(diào)了HUR和VEGF，隨后導(dǎo)入miR-582-3p抑 制劑可以恢復(fù)HUR和VEGF的表達(dá)水平。HUR的RIP實驗證實，它可以與VEGF mRNA和miR-582-3p直接結(jié)合。檢測GC組織中HUR mRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)HUR表達(dá)與miR-582-3p表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與circSHKBP1表達(dá)呈正相關(guān)。結(jié)果表明，circSHKBP1可以通過調(diào)節(jié)HUR來調(diào)控VEGF的表達(dá)。 （6）circSHKBP1直接HSP90相互作用并抑 制其降解
在HGC27細(xì)胞中用circSHKBP1探針的RNA pull-down和蛋白質(zhì)譜結(jié)果顯示兩個差異表達(dá)蛋白HSP90β和HSP90α（HSP90的異構(gòu)體）在過表達(dá)circSHKBP1的GC細(xì)胞中富集。RIP實驗顯示，circSHKBP1能直接作用于HSP90。使用qPCR和ELISA分別檢測HSP90的mRNA和蛋白水平，結(jié)果顯示GC腫 瘤組織中的HSP90 mRNA和蛋白均上調(diào)且HSP90蛋白表達(dá)與circSHKBP1表達(dá)呈正相關(guān)。然而，在過表達(dá)circSHKBP1中使用CHX抑 制蛋白，HSP90的降解受到明顯抑 制。由于泛素連接酶STUB1可以泛素化HSP90。使用蛋白酶體抑 制劑MG132處理時HSP90的降解速度減慢。結(jié)合上述研究，作者認(rèn)為circSHKBP1和STUB1競爭性結(jié)合HSP90，通過IP分析獲得證實。此外，HSP90的抑 制劑NMS-E973在體外削弱了circSHKBP1的促ai作用。這些結(jié)果表明，circSHKBP1可以直接與HSP90結(jié)合，并抑 制STUB1對HSP90的泛素化，從而促進(jìn)GC的發(fā)展。 （7）circSHKBP1調(diào)節(jié)體內(nèi)GC的生成
作者構(gòu)建了circSHKBP1沉默株系（LV3-sh1、LV3-sh2）和超表達(dá)株系（LV5-circSHKBP1），將相應(yīng)細(xì)胞接種到小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)源自LV3-sh1細(xì)胞的腫 瘤明顯小于源自LV3-NC的，表明敲低circSHKBP1會抑 制腫 瘤生長。另外，將轉(zhuǎn)導(dǎo)LV5-circSHKBP1和LV5-NC的細(xì)胞接種到裸鼠體內(nèi)，并對每組中一半數(shù)量的小鼠每周給予兩次VEGF抗體。發(fā)現(xiàn)源自LV5-circSHKBP1細(xì)胞的腫 瘤比源自LV5-NC細(xì)胞的腫 瘤更大且更重。此外，qPCR 鑒定血清外泌體和腫 瘤的circSHKBP1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)外泌體circSHKBP1依賴于ai組織circSHKBP1的表達(dá)，這證實了circSHKBP1可通過外泌體遞送到其他部位，并可在循環(huán)系統(tǒng)中檢測，這使其可能成為一種很有潛力的GC分子標(biāo)志物。 （8）circSHKBP1調(diào)控體內(nèi)GC的轉(zhuǎn)移
為了探索circSHKBP1對體內(nèi)胃ai轉(zhuǎn)移的影響，作者將熒光素轉(zhuǎn)染到上述5個細(xì)胞系，然后注入裸鼠體內(nèi)。LV5-circSHKBP1和LV5-NC組中的一半的小鼠每周接受兩次VEGF抗體處理。結(jié)果表明，敲低circSHKBP1可顯 著減少肺轉(zhuǎn)移灶的數(shù)目和大小且ISH顯示，敲低circSHKBP1會導(dǎo)致GC肺轉(zhuǎn)移灶中的HUR和VEGF染色明顯減少。而過表達(dá)circSHKBP1可以加重肺轉(zhuǎn)移病變和增加HUR和VEGF染色。而VEGF抗體可以抑 制circSHKBP1誘導(dǎo)的ai細(xì)胞轉(zhuǎn)移。 3. 外泌體circPACRGL通過miR-142-3p/miR-506-3p- TGF- cm1過程驅(qū)動大腸ai的惡化
發(fā)表期刊：Molecular Cancer
影響因子：15.302
發(fā)表時間：2020.7.27
文章鏈接：Exosomal circPACRGL promotes progression of colorectal cancer via the miR-142-3p/miR-506-3p- TGF-β1 axis
2020年7月27日，發(fā)表于Molecular Cancer（IF=15.302）的“Exosomal circPACRGL promotes progression of colorectal cancer via the miR-142-3p/miR-506-3p- TGF-β1 axis”首 次揭示了來源于腫 瘤細(xì)胞外泌體的circPACRGL在大腸ai增殖和轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制，為深入研究circRNA在大腸ai治 療中的作用機(jī)制提供了新的理論依據(jù)。 （1）大腸ai（CRC）來源的外泌體可刺激CRC增殖、遷移和侵襲
為了探索外泌體在CRC中的作用機(jī)制，作者首先從CRC細(xì)胞系HCT116和SW480的上清液中分離出ai細(xì)胞衍生的外泌體。CCK8、傷口愈合實驗和Transwell assay顯示，過表達(dá)外泌體顯 著增強了CRC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。流式細(xì)胞儀分析顯示，在過表達(dá)外泌體的CRC細(xì)胞中，凋亡細(xì)胞數(shù)目顯 著低于對照細(xì)胞，WB結(jié)果顯示，CRC衍生的外泌體增加了ai細(xì)胞相關(guān)的蛋白水平。此外，測試了CRC衍生的外泌體在體內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤模型中的作用，作者發(fā)現(xiàn)外泌體處理顯 著增加了HCT116細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。綜上所述，CRC衍生的外泌體可促進(jìn)CRC增殖、遷移和侵襲。 （2）添加腫 瘤來源的外泌體后，circPACRGL在大腸ai細(xì)胞中顯 著上調(diào)
通過外泌體環(huán)狀RNA測序分析了HCT116和SW480細(xì)胞外泌體（Ex-HCT116和Ex-SW480）的表達(dá)譜。Venn顯示circPAGAL（也稱為has_circ_0069313）是兩個Ex組中上調(diào)特為顯 著的基因，并通過qPCR證實。qPCR顯示在腫 瘤來源的外泌體刺激下，CRC細(xì)胞中circPACRGL的表達(dá)顯 著上調(diào)，且circPACRGL可能來源于腫 瘤衍生的外泌體。為了研究circPACRGL是否為CRC進(jìn)展所必需的，作者進(jìn)行了功能缺失分析，將circPACRGL-siRNA轉(zhuǎn)染到HCT116和SW480細(xì)胞中敲低circPACRGL后，使用腫 瘤來源的外泌體刺激兩種CRC細(xì)胞，顯示circPACRGL mRNA表達(dá)顯著增加。這些結(jié)果表明，circPACRGL主要來自腫 瘤來源的外泌體。 （3）circPACRGL作為海綿分子結(jié)合miR-142-3p和miR-506-3p
作者使用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫預(yù)測發(fā)現(xiàn)circPACRGL同時具有miR-142-3p和miR-506-3p的結(jié)合位點，雙熒光素酶報告實驗檢測也證實miR-142-3p和miR-506-3p可與circPACRGL直接結(jié)合。此外，在CRC細(xì)胞來源的外泌體刺激的HCT116和SW480細(xì)胞中，miR-142-3p和miR-506-3p表達(dá)均顯 著降低。這些結(jié)果表明，circPACRGL可以海綿吸附miR-142-3p和miR-506-3p，并抑 制二者的表達(dá)。 （4）miR-142-3p / miR-506-3p均可調(diào)節(jié) TGF-β1
使用生物信息學(xué)預(yù)測了miR-142-3p和miR-506-3p的下游靶基因TGF-β1。通過雙熒光素酶報告實驗，證實了TGF-β1是miR-142-3p和miR-506-3p的共同靶基因。qPCR和WB分析進(jìn)一步表明，轉(zhuǎn)染miR-142-3p/miR-506-3p可顯 著降低TGF-β1的mRNA和蛋白水平。為了進(jìn)一步證實miR-142-3p和miR-506-3p對TGF-β1的調(diào)節(jié)作用，作者使用miR-142-3p/miR-506-3p 處理CRC衍生的外泌體刺激的CRC細(xì)胞，結(jié)果顯示導(dǎo)入CRC衍生的外泌體后，CRC細(xì)胞中TGF-β1的mRNA和蛋白水平均顯 著增加，而與miR-142-3p/miR-506-3p共同處理后，TGF-β1表達(dá)的促進(jìn)作用被有效抑 制。綜上所述，TGF-β1是miR-142-3p和miR-506-3p的共同靶標(biāo)。 （5）circPACRGL通過海綿機(jī)制吸附miR-142-3p /miR-506-3p進(jìn)而調(diào)控TGF-β1促進(jìn)CRC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲
根據(jù)以上數(shù)據(jù)，作者推測circPACRGL可能通過miR-142-3p /miR-506-3p-TGF-β1軸來調(diào)控CRC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。CCK8結(jié)果顯示，在CRC衍生的外泌體治 療組（Ex-HCT116）中，CRC細(xì)胞增殖明顯高于對照組。敲低circPACRGL顯 著降低了CRC細(xì)胞增殖，而miR-142-3p/miR-506-3p抑 制劑處理或過表達(dá)TGF-β1后，這種抑 制作用會相應(yīng)減弱。在細(xì)胞凋亡實驗中也觀察到了類似的效果。接下來，劃痕實驗和Transwell分析均顯示CRC衍生的外泌體可以增強CRC細(xì)胞的遷移和侵襲能力，而在circPACRGL敲低的細(xì)胞中則發(fā)生了相反的作用，CRC衍生的外泌體處理可以回補circPACRGL敲低細(xì)胞的遷移和侵襲能力。與CCK8和細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果一致，miR-142-3p / miR-506-3p抑 制劑處理或過表達(dá)TGF-β1顯著促進(jìn)了circPACRGL敲低細(xì)胞的遷移和侵襲能力。以上結(jié)果表明，circPACRGL通過調(diào)節(jié)miR-142-3p /miR-506-3p-TGF-β1過程促進(jìn)CRC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。 （6）來源于CRC的外泌體circPACRGL通過miR-142-3p /miR-506-3p-TGF-β1過程調(diào)節(jié)N1-N2中性粒細(xì)胞的分化
上述研究表明，circPACRGL通過miR-142-3p/miR-506-3p-TGF-β1過程促進(jìn)大腸ai的發(fā)展。作者進(jìn)一步探討CRC衍生的外泌體circPACRGL是否也可以通過這個軸調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞的N1-N2分化。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，CRC衍生的外泌體可以增加N2中性粒細(xì)胞的百分比，這與N2標(biāo)記物CD11b + / Ly6G + / Ly6Clow的上調(diào)相一致。相比之下，在circPACRGL敲低的細(xì)胞中，N2中性粒細(xì)胞的百分比顯著降低，而加入CRC衍生的外泌體后，這種抑 制作用被取消。此外，miR-142-3p/miR-506-3p抑 制劑處理或過表達(dá)TGF-β1可以顯 著增加circPACRGL敲低細(xì)胞中N1-N2的分化。綜上分析，CRC衍生外泌體的circPACRGL通過miR-142-3p /miR-506-3p-TGF-β1過程促進(jìn)N1-N2中性粒細(xì)胞的分化。 總結(jié)
總體來說，上述三篇研究通過外泌體提取、外泌體鑒定、外泌體環(huán)狀RNA測序、qRT-PCR、Sanger測序、RNA pull-down+MS/WB、RIP以及雙熒光素酶報告實驗等方法（云序可提供以上服務(wù)），探究外泌體環(huán)狀RNA通過海綿機(jī)制吸附miRNA進(jìn)而調(diào)控下游疾病相關(guān)基因mRNA的表達(dá)過程，結(jié)果影響ai癥發(fā)展進(jìn)程。這為研究和理解生物體復(fù)雜的外泌體環(huán)狀RNA調(diào)控機(jī)制，提供了比較完整的實驗研究思路和方案，具有很強的理論先導(dǎo)性和示范性，也為疾病的調(diào)控和靶點提供了重要的理論依據(jù)。