前不久，來(lái)自加州大學(xué)舊金山分校（UCSF），西奈山醫(yī)院（Mount Sinai），法國(guó)巴斯德研究所（Institut Pasture），歐洲分子生物實(shí)驗(yàn)室（EMBL）等49個(gè)研究單位的125位研究人員合作完成了對(duì)SARS-CoV-2蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的分析。這項(xiàng)研究的結(jié)果于4月30日以標(biāo)題 “A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing” 發(fā)表在了Nature期刊。此次研究是迄今為止對(duì)SARS-CoV-2與人類(lèi)宿主細(xì)胞之間蛋白互作網(wǎng)絡(luò)最系統(tǒng)和深入的分析，揭示了新冠病毒在感染過(guò)程中如何操縱宿主細(xì)胞。通過(guò)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)互作圖研究者們發(fā)現(xiàn)了多個(gè)針對(duì)宿主的蛋白靶點(diǎn)，而這些靶點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的已有藥物和在研藥物對(duì)于治療COVID-19具有極大的潛能。



研究設(shè)計(jì)思路

研究者們克隆并在人細(xì)胞系HEK293T/17中表達(dá)了29個(gè)SARS-CoV-2蛋白中的26個(gè)，然后用親和純化/質(zhì)譜（AP-MS）確定了332個(gè)高置信度的SARS-CoV-2-人蛋白互作（PPIs）。從這些PPI中，他們找到了被69種已知藥物（29個(gè)FDA批準(zhǔn)的藥物，12個(gè)處于臨床實(shí)驗(yàn)階段的藥物，28個(gè)臨床前化合物）靶向的66個(gè)人蛋白或宿主因子。接下來(lái)，來(lái)自美國(guó)西奈山醫(yī)院和法國(guó)巴斯德研究所的兩個(gè)團(tuán)隊(duì)各自利用Celigo免疫熒光成像分析和qRT-PCR的方法對(duì)一部分藥物進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)篩選，發(fā)現(xiàn)兩類(lèi)化合物具有病毒抑制能力：1）mRNA轉(zhuǎn)譯抑制劑和  2）Sigma1和Sigma2受體的潛在調(diào)節(jié)劑。對(duì)這些靶向宿主因子的化合物進(jìn)行更深入的研究，以及探索與靶向病毒蛋白的藥物的聯(lián)合使用，可能會(huì)成為COVID-19藥物開(kāi)發(fā)的新思路。

以下是此篇文章的重點(diǎn)結(jié)果和方法解讀。

SARS-CoV-2宿主互作蛋白的全面分析

通過(guò)AP-MS, 研究者們確定了332個(gè)高置信度的SARS-CoV-2-人蛋白互作，并對(duì)這些人蛋白的生物學(xué)功能和組織表達(dá)水平進(jìn)行了研究（Fig. 1a）。SARS-CoV-2的蛋白參與了一些重要的宿主細(xì)胞活動(dòng)，包括脂蛋白代謝（S），細(xì)胞核運(yùn)輸（Nsp7），和核糖核蛋白復(fù)合物合成（Nsp8）（Fig. 1b）。在29個(gè)人類(lèi)組織中，相關(guān)蛋白在肺中的表達(dá)水平最高（Fig. 1c）。在感染過(guò)程中，病毒蛋與其相互作的人蛋白的豐度變化有很強(qiáng)的相關(guān)性（Fig. 1d）。通過(guò)與其他病原體-宿主的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖相比較，研究者們發(fā)現(xiàn)西尼羅病毒（WNV）和結(jié)核分支桿菌（Mtb）與SARS-CoV-2擁有最相似的網(wǎng)絡(luò)分布（Fig. 1e）。值得注意的是，結(jié)核分支桿菌也可以感染肺組織。
 

蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖刷新了人們對(duì)SARS-CoV-2的認(rèn)知

SARS-CoV-2與人蛋白之間復(fù)雜的互作網(wǎng)絡(luò)涉及了多個(gè)復(fù)合物和生物過(guò)程，包括DNA復(fù)制，表觀遺傳和基因表達(dá)調(diào)控，囊泡運(yùn)輸，脂類(lèi)修飾，RNA加工和調(diào)節(jié)，泛素連接酶，信號(hào)傳導(dǎo)，細(xì)胞核運(yùn)輸，細(xì)胞骨架，線(xiàn)粒體和細(xì)胞外基質(zhì)（Fig. 2）。大約40%的SARS-CoV-2互作蛋白與內(nèi)膜或囊泡運(yùn)輸路徑有關(guān)。這些互作可能在病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞時(shí)起到輔助作用。

研究還發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2與天然免疫信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)蛋白有相互作用。比如Nsp13, Nsp15和Orf9b與IFN路徑有關(guān)聯(lián)； Nsp13和Orf9與cNF-κB路徑有關(guān)聯(lián)。另外，兩個(gè)調(diào)控抗病毒天然免疫信號(hào)傳導(dǎo)的E3泛素連接酶，TRIM59和MIB1，分別和Orf3a與Nsp9相結(jié)合。

SARS-CoV-2還會(huì)影響宿主細(xì)胞蛋白的轉(zhuǎn)譯過(guò)程。病毒的核衣殼可以結(jié)合應(yīng)激顆粒（SG）蛋白G3BP1/2，還有mTOR調(diào)控的轉(zhuǎn)譯抑制因子LARP1, 蛋白激酶CK2，mRNA降解因子UPF1和MOV10。應(yīng)激顆粒的形成是最早發(fā)生的抗病毒反應(yīng)之一。對(duì)應(yīng)激顆粒和相關(guān)RNA路徑進(jìn)行操控在冠狀病毒中很常見(jiàn)。由eIF4A抑制劑促進(jìn)的G3BP聚集也許是其抗病毒能力的原理。

靶向SARS-CoV-2人源宿主因子的現(xiàn)有藥物

借助化學(xué)信息學(xué)工具，研究者們找到了靶向SARS-CoV-2人源宿主因子的16個(gè)批準(zhǔn)藥物，3個(gè)在研藥物（臨床實(shí)驗(yàn)階段），以及18個(gè)臨床前候選藥物；另外，通過(guò)基于靶點(diǎn)和信號(hào)通路的文獻(xiàn)搜索，他們還發(fā)現(xiàn)了13個(gè)批準(zhǔn)藥物，9個(gè)臨床實(shí)驗(yàn)階段的在研藥物（INDs），和10個(gè)臨床前候選藥物。在所有332個(gè)高置信度人蛋白靶點(diǎn)中，有63個(gè)擁有已知靶向分子，總計(jì)69種批準(zhǔn)藥物/INDs/臨床前化合物。


宿主靶向藥物的病毒抑制能力

接下來(lái)，研究者們對(duì)這些藥物的抗病毒活性進(jìn)行了分析。這項(xiàng)工作由來(lái)自紐約的西奈山醫(yī)院和巴黎的巴斯德研究所的兩個(gè)團(tuán)隊(duì)分別完成。西奈山醫(yī)院團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種中等通量的基于Celigo免疫熒光成像的方法（檢測(cè)病毒核蛋白NP），在非洲綠猴腎細(xì)胞系Vero E6中對(duì)37種化合物進(jìn)行了SAR-CoV-2感染抑制篩選。巴斯德所團(tuán)隊(duì)則通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞上清病毒RNA的方法分析了44種藥物的病毒抑制能力（Fig. 3a）。兩個(gè)團(tuán)隊(duì)一共對(duì)69個(gè)藥物中的47個(gè)進(jìn)行了檢測(cè)，另外還有13個(gè)靶向SaigmaR1/R2受體和mRNA轉(zhuǎn)譯的化合物，以及額外的15個(gè)其他方法篩選出的小分子。

病毒抑制實(shí)驗(yàn)方法（西奈山醫(yī)院）

將Vero E6細(xì)胞以2000細(xì)胞/孔接種于96孔板（由于Vero E6是腎細(xì)胞系，因此不排除藥物在肺細(xì)胞中會(huì)產(chǎn)生不同的結(jié)果）。病毒感染前2小時(shí)，將培養(yǎng)基替換為含有待測(cè)藥物/化合物的培養(yǎng)基，對(duì)照孔加入相應(yīng)濃度的DMSO。將培養(yǎng)板轉(zhuǎn)移至P3安全等級(jí)實(shí)驗(yàn)室，加入100 PFU (MOI 0.025)的SARS-CoV-2，于37C培養(yǎng)48小時(shí)。感染完成后，去掉上清，向板中加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞。24小時(shí)后，將培養(yǎng)板移出P3實(shí)驗(yàn)室。接下來(lái)，對(duì)細(xì)胞中的病毒核蛋白（NP）進(jìn)行免疫熒光染色（SARS-CoV 抗血清，1：10000），并用DAPI染細(xì)胞核。Celigo成像細(xì)胞分析儀（Nexcelom Bioscience）被用于對(duì)感染的細(xì)胞（AF488）和總細(xì)胞（DAPI）進(jìn)行熒光成像和定量分析。細(xì)胞中綠色熒光（NP）的強(qiáng)度反映了病毒感染的程度。感染率百分比可以通過(guò)((感染細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)) – 背景) x 100%計(jì)算出。DMSO對(duì)照組的感染率被設(shè)置為100%以完成歸一化。IC50和IC90值通過(guò)將Celigo的數(shù)據(jù)導(dǎo)出至GraphPad分析得出。

對(duì)于挑選出的藥物，研究者們用被感染細(xì)胞的上清進(jìn)行了病毒滴度檢測(cè)并計(jì)算出TCID50。具體步驟為：SARS-CoV-2感染48小時(shí)后收集細(xì)胞上清，凍存于-80 ˚C直至使用。將Vero E6細(xì)胞以20000細(xì)胞/孔接種于96孔板。第二天，加入10倍梯度稀釋?zhuān)?0^1 到10^6）的含SARS-CoV-2上清的培養(yǎng)基。五天后，將細(xì)胞用結(jié)晶紫染色，觀察細(xì)胞病變（CPE）。用Reed&Muench方法計(jì)算TCID50/mL。

病毒抑制實(shí)驗(yàn)方法（巴斯德所）

病毒抑制實(shí)驗(yàn)的前幾個(gè)步驟和西奈山醫(yī)院團(tuán)隊(duì)的方法基本一致（不過(guò)每孔加入SARS-CoV-2的MOI為0.1）。病毒感染48小時(shí)后，收集細(xì)胞上清用于RNA提取和qRT-PCR。根據(jù)已知病毒滴度做出的RNA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算出上清中病毒基因?qū)��?yīng)的PFU數(shù)值。



病毒滴度檢測(cè)（巴斯德所）

病毒的滴度是通過(guò)蝕斑實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)的。將Vero E6細(xì)胞以7.5x10^4/孔的密度接種于24孔板。第二天，加入10倍稀釋的含病毒培養(yǎng)基，于37˚C孵育1小時(shí)。隨后，加入0.005%瓊脂糖形成半固體覆蓋層。于37˚C孵育3天后用4%多聚甲醛固定和結(jié)晶紫染色，肉眼觀察和計(jì)數(shù)每孔蝕斑數(shù)量（plaque assay）。

西奈山醫(yī)院團(tuán)隊(duì)用于檢測(cè)藥物抑制病毒能力的儀器為Celigo高通量成像細(xì)胞分析儀。該儀器配備有1個(gè)明場(chǎng)和4個(gè)熒光通道，能對(duì)生長(zhǎng)在微孔板中的細(xì)胞進(jìn)行高速全孔高清成像（檢測(cè)一塊96孔板的病毒抑制實(shí)驗(yàn) < 15分鐘），并用內(nèi)置軟件識(shí)別每一個(gè)細(xì)胞，完成多重參數(shù)（包括細(xì)胞數(shù)量、大小、平滑度、平均熒光強(qiáng)度、總熒光強(qiáng)度、不同類(lèi)型細(xì)胞百分比等）的定量分析。



病毒抑制/抗體中和的常用實(shí)驗(yàn)方法有很多種，包括如蝕斑減少中和實(shí)驗(yàn)（PRNT），病毒灶減少中和實(shí)驗(yàn)（FRNT）和基于ELISA的微中和實(shí)驗(yàn)等。與這些方法相比，基于自動(dòng)熒光成像的方法節(jié)省人力和時(shí)間，減少了人為誤差，通量高，靈敏度高，動(dòng)態(tài)范圍廣，所需病毒量少（MOI低），非常適合抗病毒藥物的高通量篩選。

值得注意的是法國(guó)巴斯德所團(tuán)隊(duì)采用的方法更為傳統(tǒng)。qRT-PCR具有很高的靈敏度，因此也更容易產(chǎn)生交叉污染，對(duì)實(shí)驗(yàn)者的操作有很高的要求。另外，qRT-PCR反映的是RNA總量，不能直接體現(xiàn)病毒的感染復(fù)制能力。

用于病毒滴度檢測(cè)的蝕斑實(shí)驗(yàn)通常只能肉眼人工計(jì)數(shù)，速度慢，通量低，且無(wú)法避免人為誤差。Celigo可以對(duì)蝕斑實(shí)驗(yàn)的孔板進(jìn)行全孔成像，軟件自動(dòng)識(shí)別蝕斑，得到每孔蝕斑數(shù)量、大小、平滑度等多個(gè)參數(shù)。Celigo也能檢測(cè)HRP或熒光染色的病毒灶斑，甚至分析單個(gè)細(xì)胞水平的病毒感染率。



細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

西奈山醫(yī)院團(tuán)隊(duì)用MTT方法對(duì)有和沒(méi)有感染SARS-CoV-2的Vero E6細(xì)胞進(jìn)行了藥物濃度梯度的毒性實(shí)驗(yàn)。巴斯德所團(tuán)隊(duì)用阿爾瑪藍(lán)試劑檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞存活率的影響。細(xì)胞存活率百分比通過(guò)基于健康細(xì)胞（100%）和乙醇處理的細(xì)胞（0%）做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算得出。

藥物安全性評(píng)估是藥物篩選中非常重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。常用的檢測(cè)細(xì)胞毒性的方法大多基于細(xì)胞的酶活性和能量代謝，比如本文作者使用的MTT和阿爾瑪藍(lán)，還有CCK-8, CellTiterGlo等。然而越來(lái)越多的研究顯示這類(lèi)方法得出的藥物對(duì)細(xì)胞活性的影響與實(shí)際有偏差，尤其是能直接影響細(xì)胞酶活性和能量代謝的藥物。

基于熒光染色的細(xì)胞計(jì)數(shù)是目前公認(rèn)最準(zhǔn)確的細(xì)胞活性檢測(cè)方法。不同熒光染料的組合包括AO/PI, Calcein AM/PI, PI/Hoechst等。對(duì)于西奈山團(tuán)隊(duì)的實(shí)驗(yàn)設(shè)置，在病毒感染和藥物處理過(guò)程中加入PI，免疫熒光和DAPI染色后即可在同一塊板上檢測(cè)藥物毒性。Celigo可以快速準(zhǔn)確地得出整板細(xì)胞數(shù)和存活率，非常適合于高通量藥物細(xì)胞毒性評(píng)估。

mRNA轉(zhuǎn)譯和Sigma受體抑制劑的SARS-CoV-2抑制作用

兩個(gè)團(tuán)隊(duì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示有兩類(lèi)化合物可以抑制病毒感染：mRNA轉(zhuǎn)譯抑制劑（zotatifin, ternatin-4和PS3061; Fig. 3b, Extended Data Fig. 9）和Sigma1與2受體的抑制劑（包括haloperidol, PB28, PD-144418和正處于臨床實(shí)驗(yàn)階段的羥氯喹）。其他的Sigma1和Sigma2受體抑制劑clemastine, cloperastine和孕酮（Fig 3c, Extended Data Fig. 9）也具有病毒抑制能力。Fig. 3d展示的是用TCID50方法做出的部分藥物病毒抑制曲線(xiàn)。值得注意的是，該結(jié)果顯示PB28（IC90 = 280 nM）比羥氯喹的效力強(qiáng)~20倍。

西奈山團(tuán)隊(duì)也用Celigo熒光成像法檢測(cè)了病毒感染前后不同時(shí)間加藥對(duì)病毒感染（熒光強(qiáng)度）的影響。該實(shí)驗(yàn)用較高滴度（MOI=2）的病毒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行單輪感染（8小時(shí)）。結(jié)果顯示羥氯喹、PB28和zotatifin不論在感染前還是感染后加入，對(duì)病毒感染的抑制能力是相似的（Fig. 3e），說(shuō)明這些藥物是在病毒復(fù)制的過(guò)程中發(fā)揮作用的。



研究者們相信，靶向Sigma1和2受體的小分子以不同于轉(zhuǎn)譯抑制的路徑抑制病毒感染，比如通過(guò)調(diào)控細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)。值得關(guān)注的是，一些靶向Sigma受體的化合物，比如clemastine, cloperastine和孕酮，都是經(jīng)FDA批準(zhǔn)上市多年的藥物。另外，Sigma受體靶向化合物在有明顯病毒抑制能力的同時(shí)具有較小的細(xì)胞毒性（Fig. 3b和c）。

Sigma1和2受體屬于胞內(nèi)侶伴蛋白，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)高度表達(dá)。相對(duì)于Sigma1受體，人們對(duì)Sigma2受體的了解較少。Sigma1受體可以調(diào)控電壓依賴(lài)的離子通道，因而影響神經(jīng)元的激活和突觸活動(dòng)，在突觸可塑性，學(xué)習(xí)和記憶中都起到重要作用。此外，有證據(jù)表明Sigma-1受體和帕金森以及重度抑郁癥有關(guān)聯(lián)，因此成為這類(lèi)疾病的熱門(mén)靶點(diǎn)。

討論與總結(jié)

本次研究獲得的化學(xué)-蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果不僅提供了以SARS-CoV-2的人互作蛋白為靶點(diǎn)的潛在化合物信息，也揭示了這些化合物可能的作用機(jī)制。mRNA轉(zhuǎn)譯抑制劑顯示出較強(qiáng)的病毒抑制作用（有效濃度在10 – 100 nM之間），使得這類(lèi)化合物成為極具吸引力的潛在藥物。雖然靶向Sigma1和2受體化合物的作用機(jī)制還不清楚，但是它們對(duì)病毒感染的控制能力值得關(guān)注。PB28的高效力（280 nM IC90）和高特異性使其擁有很高的成藥潛力。還有許多已批準(zhǔn)的Sigma靶向藥物擁有老藥新用的潛能，值得評(píng)估其對(duì)SARS-CoV-2的抑制能力。

作為抗病毒療法，宿主靶向的干預(yù)方式可以避免因病毒變異而產(chǎn)生的藥物抗性，也為開(kāi)發(fā)廣譜抗病毒療法從而應(yīng)對(duì)未來(lái)其他病毒的爆發(fā)提供了可能性。另外，宿主靶向藥物可以和病毒靶向藥物（比如瑞德西韋）組成聯(lián)合療法，以達(dá)到更好的病毒抑制效果。更重要的是，本次研究所展示的工作流程代表了藥物發(fā)現(xiàn)（不局限于廣譜抗病毒療法，也適用于其他疾病療法的開(kāi)發(fā)）的一種新方法，也是國(guó)際間多學(xué)科合作促進(jìn)科學(xué)發(fā)展的一次完美體現(xiàn)。