基因調(diào)控區(qū)的DNA甲基化狀態(tài)的改變可導(dǎo)致多種癌癥的發(fā)生。這種表觀遺傳學(xué)改變在生物學(xué)上是穩(wěn)定的，并存在于循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）中，使其適合于早期檢測和無創(chuàng)動態(tài)監(jiān)測腫瘤負(fù)荷。數(shù)字PCR技術(shù)憑借其較高的靈敏度、精準(zhǔn)度以及對抑制劑的耐受度，在對低拷貝樣品檢測時表現(xiàn)出了極大的優(yōu)勢。

在轉(zhuǎn)移性和II/III期結(jié)直腸癌（CRC）患者中，WNT抑制因子1（WIF1）和神經(jīng)肽T（NPY）的甲基化程度較高，為了評估是否可以使用WIF1和NPY的甲基化程度作為一種結(jié)直腸癌標(biāo)志物，法國Stilla Technologies聯(lián)合法國國家科學(xué)研究中心（CNRS）、AP-HP等相關(guān)單位建立了一種將亞硫酸氫鹽法（bisulfite-將未甲基胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶）與數(shù)字PCR相結(jié)合的方法。

為了檢測WIF1和NPY，利用亞硫酸氫鹽-3色dPCR檢測方法，選擇白蛋白基因ALB作為參考基因，測試了從健康個體和CRC患者血漿中提取的ctDNA。并對WIF1和NPY的LOB和LOD進(jìn)行評估。

3色Naica Crystal Digital PCR檢測WIF1和NPY

分別檢測了10個來自III期或IV期CRC患者和5個健康個體的血漿樣品。來自CRC患者的所有血漿DNA樣本的高甲基化WIF1和NPY得分均為陽性，而在健康個體中未檢測到高甲基化的WIF1和NPY。通過將WIF1和NPY濃度與ALB參考濃度對比評估，血漿DNA中的高甲基化WIF1比例范圍為8％至93％，而高甲基化NPY的比例范圍為0.1％至78％。血漿樣品中檢測到的最低甲基化WIF1和NPY量分別為5.1和1.2cp/μL。

通過上述方法，即經(jīng)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化后再進(jìn)行3色數(shù)字PCR方法，能夠在每25μL體系中可靠的檢測低至25和5個拷貝的高甲基化WIF1和NPY，并且該檢測結(jié)果可以用作通用的結(jié)直腸癌標(biāo)志物和腫瘤特異性突變的替代物。使用3色Naica Crystal Digital PCR檢測WIF1和NPY，結(jié)果和理論值一致，未出假陰性和假陽性結(jié)果。

Naica數(shù)字PCR平臺

法國Stilla Technologies公司的Naica數(shù)字PCR技術(shù)在進(jìn)行核酸檢測時具有獨特的優(yōu)勢。系統(tǒng)利用cutting-edge微流體創(chuàng)新型芯片—Sapphire芯片作為數(shù)字PCR過程的唯一耗材。樣品通過毛細(xì)通道網(wǎng)格以30,000個微滴的形式進(jìn)入2D芯片中。3色熒光檢測儀器，整個流程只需要2.5小時，并可進(jìn)行數(shù)據(jù)的質(zhì)控和結(jié)果追溯分析，獲得的數(shù)據(jù)真實可靠。

數(shù)字PCR學(xué)堂

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