血球計數(shù)板一直是實驗室細胞計數(shù)的金標準。早在18世紀的法國，醫(yī)生就開始用血球計數(shù)板分析病人的血液樣本。經(jīng)過100多年的不斷改進，如今的血球計數(shù)板相比其原型在準確性和便捷程度上都有了大幅提高，成為了現(xiàn)代細胞學研究的重要工具之一（對該歷史感興趣的小伙伴，請參考《血球計數(shù)板的前世今生》）。然而，因血球計數(shù)板固有的設計和使用方法帶來的計數(shù)誤差依然存在。相信不少小伙伴都有為忽高忽低的計數(shù)結(jié)果抓狂和被巨大的CV值所震驚的經(jīng)歷…… 今天我們就來談談血球計數(shù)板的誤差來源以及如何避免或降低這些誤差。

血球計數(shù)板的計數(shù)誤差主要來自于三個方面：

      ● 隨機誤差

      ● 人為誤差

      ● 系統(tǒng)誤差

隨機誤差

隨機誤差又叫偶然誤差，是即使在完全消除系統(tǒng)誤差這種理想情況下，多次重復測量同一對象，仍會由于各種偶然的、無法預測的不確定因素干擾而產(chǎn)生的測量誤差。簡言之，這類誤差是一種自然規(guī)律，是無法避免的。

1881年，統(tǒng)計學家Lyon和Thoma推算出血球計數(shù)板的隨機誤差公式為：

其中n為所計算的細胞數(shù)

1907年，以發(fā)明了Student’s t-test而聞名的Willian Seal在一篇文獻中推導出了同樣的公式 [1, 2]。下表是用標準Neubauer型血球計數(shù)板測量不同濃度的細胞樣本時4個大方格的細胞數(shù)和理論隨機誤差：
 

 

可見細胞濃度越高，檢測細胞數(shù)越多（即樣本量越大），隨機誤差越低。因此，為了降低隨機誤差，我們可以：

-  提高細胞濃度（濃縮樣本）

-  增加檢測細胞數(shù)量（多數(shù)幾個大方格）

-  增加重復檢測的次數(shù)
 

增加細胞濃度和計數(shù)總數(shù)可以降低隨機誤差，但是濃縮步驟會引入新的誤差，操作者也需要花更多的時間用于計數(shù)。流式細胞儀或基于成像原理的自動細胞計數(shù)儀可在短時間內(nèi)分析大量細胞（比如Cellaca MX一次計數(shù)的視野要遠遠大于血球計數(shù)板，分析最快只需2秒），提高效率的同時降低了隨機誤差。另外，儀器可以測量的濃度范圍比血球計數(shù)板更廣（比如Cellometer細胞計數(shù)儀的檢測范圍為1x10^5 – 1x10^7細胞/ml），可以省去濃縮或稀釋步驟。

人為誤差

有的小伙伴可能會說，我的樣本濃度應該有1x10^6細胞/ml，但為什么我計數(shù)的CV值有時候會超過30%呢？這個鍋，統(tǒng)計學家們可不背！細胞計數(shù)誤差的另一個重要來源就是人為誤差。早在1964年統(tǒng)計學家Fruend和Carol就發(fā)表文獻指出不同操作者檢測同一樣本的計數(shù)差異可高達52% ；同一操作者不同次計數(shù)間的差異也可達到20% [3]。是不是觸目驚心？

人為誤差有哪些呢？該怎樣減少或避免呢？我們一條一條來看。

混勻

• 混勻所用的體積至少為溶液總體積的20%。比如混勻1 ml的溶液，需要將移液器體積調(diào)到至少 200 µl。試想如果用10 µl的移液器去混勻1 ml的細胞懸液，會有怎樣的后果？
• 槍頭尖端應放置在溶液的中部，不要離液面或底部太近
• 移液器上下吹打10次，力度適中，避免產(chǎn)生氣泡。成團嚴重的細胞可增加吹打次數(shù)
• 從較大容器（比如T25、T75燒瓶）中取樣時，應先用5 ml或10 ml移液器混勻，取出樣本加入較小容器（比如離心管）后再用小量程的移液器和槍頭繼續(xù)吹打混勻

稀釋和取樣

• 確保稀釋倍數(shù)計算正確
• 原液混勻后應立刻取樣，避免細胞沉淀。如果等待時間過長，應重新混勻再取樣
• 如果稀釋倍數(shù)很高（比如1:100甚至1:1000），建議梯度稀釋（比如連續(xù)做2到3次1:10的稀釋），避免原液體積過小造成誤差
• 同一樣本的重復取樣應在短時間內(nèi)完成。如果時間過長，應重新混勻再取樣

計數(shù)
細胞判斷標準必須統(tǒng)一

• 活細胞和死細胞如何定義？
• 壓線細胞如何數(shù)（數(shù)上不數(shù)下？數(shù)左不數(shù)右？）
• 成團細胞數(shù)一個還是分開數(shù)？

混勻、稀釋和取樣都是生物實驗的基本操作。除了細胞計數(shù)，這些基本功在其他的實驗中也是必不可少的。所以小伙伴們要好好修煉��！當然，如果你的實驗室是土豪級別，可以用自動化設備（比如液體工作站）完成這些操作，那也是極好的。

細胞的判斷標準是計數(shù)誤差來源中主觀性最強的一個因素。即使有統(tǒng)一的標準，在執(zhí)行時也難免有所偏差，所以才會出現(xiàn)前文提到的觸目驚心的操作者之間和不同次計數(shù)間的差異。自動細胞計數(shù)儀由軟件的參數(shù)定義和識別細胞，判斷標準不會隨人、時間或其他條件而改變，可以完美解決這一問題。

系統(tǒng)誤差
系統(tǒng)誤差是非隨機誤差，是由測量與分析過程中某些固定的原因引起的一類誤差，它具有重復性、單向性和可測性。就如同打靶時如果每次都擊中同一區(qū)域，但都離靶心相去甚遠，那么擊中的區(qū)域到靶心的距離就是系統(tǒng)誤差。
 

在細胞計數(shù)中，我們可以把隨機誤差和人為誤差控制到最低，得到很好的可重復性（即很小的CV值，很高的精密度），但是測得的結(jié)果有可能和實際值仍有差異（即較差的準確度）。此時就需要考慮到系統(tǒng)誤差，主要包括血球計數(shù)板的品牌、工藝和規(guī)格以及其他器材的選擇。

血球計數(shù)計數(shù)板

• 必須從正規(guī)渠道購買正規(guī)品牌的血球計數(shù)板
• 血球計數(shù)板的蓋玻片必須使用原裝配套的。蓋玻片的材質(zhì)、重量和尺寸的變化會直接影響計數(shù)室的高度和體積
• 蓋玻片須擺放正確以確保加樣體積準確
• 使用過的血球計數(shù)板必須清洗干凈、晾干后再使用，避免樣本間交叉污染

血球計數(shù)板屬于精密設備，在使用時有諸多細節(jié)需要注意，步驟繁瑣。而且每次只能加載兩個樣本，耗費精力，效率低下。一次性標準規(guī)格的計數(shù)板（比如Cellometer計數(shù)板）的體積和計數(shù)面積固定，在出廠時都經(jīng)過精密測量，不存在使用不當造成的差異，也避免了樣本間的交叉污染。結(jié)合使用細胞計數(shù)儀能大幅縮短計數(shù)時間，提高工作效率。

其他器材

• 使用校準過的移液器以確保取樣體積準確
• 使用低吸附槍頭和離心管以避免細胞和溶液掛壁

看完了今天的分享，小伙伴們是不是對細胞計數(shù)有了更深的了解？當有人向你提出諸如“用血球計數(shù)板數(shù)1x10^5/ml濃度的樣本時CV也必須達到5%以下”的“無理要求”時，你知道該怎樣用科學的態(tài)度予以回應了吧？如果你仍心有疑慮，或?qū)Ψ揭琅f不服，歡迎留言或致電021-58860038，Nexcelom的應用科學家們會非常樂意和大家繼續(xù)探討這個有趣的話題。

參考文獻

1.Student. On the Error of Counting with a Haemacytometer. Biometrika 1907; 5(3): 351-60.

2.Shapiro HM. "Cellular Astronomy" - A Foreseeable Future in Cytometry. Cytometry Part A 2004; 60A:115-24.

3.Freund M, Carol B. Factors Affecting Haemocytometer Counts of Sperm Concentration in Human Semen. Journal of Reproductive Fertility 1964; 8: 149-55.

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