化學(xué)發(fā)光Western Blot的流程大家再熟悉不過，近紅外熒光Western與化學(xué)發(fā)光步驟基本相似，但是有些小伙伴做不好熒光Western，小編給大家總結(jié)了做熒光Western的幾點(diǎn)注意事項(xiàng)：

一、做近紅外熒光Western選擇低熒光背景膜，降低膜對(duì)信號(hào)的影響。

二、選擇合適的封閉液，沒有一種封閉液適用所有的Western Blot檢測(cè)，需要大家進(jìn)行優(yōu)化，如果做磷酸化蛋白檢測(cè)，不建議使用牛奶為基礎(chǔ)的封閉液，如果做酪氨酸蛋白，不建議使用BSA為基礎(chǔ)的封閉液，Azure提供熒光封閉試劑，減少非特異性條帶結(jié)合，降低背景。

三、漂洗也是非常重要的一步，使用干凈的孵育盒，足夠多的漂洗液，一般含有吐溫的濃度0.1%-0.2%，如果背景特別高，加入少量的SDS可以明顯降低背景，SDS添加只能用于PVDF膜，濃度一般為0.01%-0.02%。Azure提供熒光印跡漂洗buffer，減少熒光二抗的非特異性結(jié)合，從而產(chǎn)生高信噪比的印跡。

四、選擇特異性好的抗體，兩種一抗必須來自不同的宿主，才能被不同特異性的二抗所識(shí)別。Azure提供熒光標(biāo)記試劑盒，熒光Western Blot實(shí)驗(yàn)試劑盒和近紅外二抗，滿足客戶的需求。

五、近紅外熒光印跡膜的成像，需要成像儀器具有近紅外熒光光源，現(xiàn)在進(jìn)行近紅外染料激發(fā)最好的激光光源，Azure Imager和Sapphire都采用的激光光源，具有激發(fā)強(qiáng)度大，單色性好，信噪比高，背景低等特點(diǎn)。

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