Western Blotting技術(shù)已經(jīng)問世四十多年了，依然是蛋白分析中最常用和主流的方法。但近些年Western Blotting數(shù)據(jù)重現(xiàn)性，穩(wěn)定性，定量準(zhǔn)確性等問題，也使這項技術(shù)被推到了風(fēng)口浪尖，同時也有很多文章因為Western Blotting數(shù)據(jù)的問題而撤稿，而為了盡可能提高Western Blottig數(shù)據(jù)的可靠性和準(zhǔn)確性，期刊雜志對于接收涉及Western Blotting技術(shù)數(shù)據(jù)的文章也提出了新的要求。
 

接下來我們看看都要哪些要求：
 

1.不建議跑平行膠，因為平行膠和剝離膜孵育體系，操作條件的不一致，影響定量的準(zhǔn)確性，因此最好內(nèi)參和目的蛋白要在同一張印跡膜上

 

 

2.選擇寬態(tài)范圍的方法，確認(rèn)信號強度與所上樣量之間的線性關(guān)系，例如用膠片做化學(xué)發(fā)光方法的動態(tài)范圍就很窄，不建議使用：
 

數(shù)字成像相比膠片動態(tài)范圍更寬、定量更準(zhǔn)確

 

3.強烈推薦使用總蛋白進(jìn)行歸一化，因為看家蛋白容易受處理條件影響而發(fā)生變化，影響定量的結(jié)果，使用總蛋白定量更真實地反映目標(biāo)蛋白表達(dá)量的變化
 

 

4.提交原始數(shù)據(jù)，例如：JBC，PLOS和CELL等雜志都要求要提供原始數(shù)據(jù)
 

 

聊完了期刊雜志的一些要求，那Azure Sapphire雙模式多光譜激光成像系統(tǒng)是如何幫助您獲得滿足期刊雜志W(wǎng)estern Blotting要求的數(shù)據(jù)：
 

 

★ Sapphire是多熒光檢測系統(tǒng)，可多達(dá)4個激光光源，同時進(jìn)行4通道熒光檢測，獲得更快的工作流程和更可靠的定量數(shù)據(jù)

 

熒光Western Blotting使用熒光基團(tuán)標(biāo)記的二抗進(jìn)行檢測，膜上的靶標(biāo)蛋白濃度與可見熒光信號強度呈線性關(guān)系，實現(xiàn)真實可靠的定量分析。熒光染料發(fā)射光譜不同，因此在一張印跡膜上可實現(xiàn)多個蛋白檢測。這樣目標(biāo)蛋白和內(nèi)參蛋白在同一張膜上，就可以避免數(shù)據(jù)造假的情況發(fā)生，更容易被期刊雜志接收。

 

圖1：通過使用四種光譜不同熒光基團(tuán)標(biāo)記的二抗，可以同時檢測多達(dá)四種不同的蛋白。HeLa細(xì)胞裂解物上樣，anti-tubulin (550nm, 綠色), anti -actin (700nm紅色), anti-GAPDH (800nm, 灰色),和anti-transferrin (490nm, 藍(lán)色)這四種蛋白同時成像，沒有交叉。

 

★ Sapphire配合AzureRed總蛋白熒光染色劑可以做總蛋白歸一化和定量三個靶標(biāo)蛋白，生成可以信賴的定量Western Blotting數(shù)據(jù)

 

使用總蛋白歸一化，以校正泳道和樣品之間的差異。傳統(tǒng)的方法無法準(zhǔn)確知道條帶灰度值和強度的變化是由于樣品的生物學(xué)變化引起的，還是由于上樣或樣品的不一致性或樣品制備的差異引起的�？偟鞍讱w一化優(yōu)勢如下：
 

☑ 總蛋白比看家基因等內(nèi)參的線性檢測范圍更寬。

☑ 在整個實驗和系統(tǒng)中更加穩(wěn)定。

☑ 能有效排除實驗條件和體系對結(jié)果的影響。

☑ 更真實地反映目標(biāo)蛋白表達(dá)量的變化。

 

圖2.總蛋白歸一化和定量三個靶標(biāo)蛋白. Tubulin 紅色通道, Actin 藍(lán)色通道,GAPDH綠色通道, AzureRed/total protein 用灰色表示

 

圖3.使用總蛋白對Tubulin信號進(jìn)行歸一化，糾正上樣誤差

 

★ Sapphire配有獨特的三種檢測器設(shè)計，最大限度地提高儀器的檢測動態(tài)范圍，保證結(jié)果的準(zhǔn)確性

 

PMT檢測器用于藍(lán)光檢測和磷屏成像。

APD檢測器用于NIR，紅色和綠色熒光的檢測。

CCD檢測器用于高靈敏化學(xué)發(fā)光的檢測。

（*專利技術(shù)）

 

 

★ Sapphire提供原始數(shù)據(jù)16bit的tiff圖給到期刊，這里的tiff原始數(shù)據(jù)是指未經(jīng)裁剪，像素修改，對比度調(diào)整等任何操作的圖，保證結(jié)果的真實性和可靠性

 

Sapphire除了進(jìn)行熒光印跡膜，化學(xué)發(fā)光印跡膜檢測外，還可以進(jìn)行In cell western孔板成像、In-Gel膠，2D和2D DIGE、切片掃描、組織成像和動植物成像、同位素標(biāo)記樣品磷屏成像等。

 

 

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電話：010-57256059