​文章導(dǎo)讀

外泌體是指包含多種RNA（環(huán)狀RNA、miRNA、LncRNA和mRNA等）和蛋白質(zhì)的盤(pán)狀囊泡（30-200nm）。幾乎所有類型的細(xì)胞均可分泌外泌體，且外泌體天然存在于各種體液中，包括血液、唾液、尿液、腦脊液和乳汁等。外泌體被視為特異性分泌的膜泡，能夠參與細(xì)胞間通訊。目前，有關(guān)外泌體分泌、攝取、內(nèi)容物以及相應(yīng)功能的精確分子機(jī)制的研究才剛剛起步，對(duì)外泌體的研究興趣也是日益增長(zhǎng)。

2020年2月6日，外泌體領(lǐng)域大牛Raghu Kalluri教授在Science雜志（影響因子41.037）發(fā)表了關(guān)于外泌體的綜述，該綜述介紹了外泌體的生物發(fā)生、異質(zhì)性、以及細(xì)胞間通信過(guò)程，同時(shí)也分析總結(jié)了外泌體在哺乳動(dòng)物的繁殖和發(fā)育、神經(jīng)退行性疾病、代謝和心血管疾病、免疫反應(yīng)和感染、癌癥以及在臨床診斷和治療應(yīng)用等領(lǐng)域中的重要價(jià)值，激發(fā)了該領(lǐng)域的研究熱度。2020年1月2日，The Journal of Clinical Investigation雜志（影響因子12.282）刊登了一篇外泌體lncRNA LNMAT2促進(jìn)膀胱癌淋巴轉(zhuǎn)移過(guò)程的文章。該篇文章巧妙利用多種技術(shù)揭示了外泌體lncRNA介導(dǎo)的淋巴轉(zhuǎn)移機(jī)制，并將LNMAT2作為膀胱癌淋巴轉(zhuǎn)移的治療靶點(diǎn)。

發(fā)表期刊：The Journal of Clinical Investigation
影響因子：12.282
實(shí)驗(yàn)方法：LncRNA-seq、RNA pull-down+MS/WB、RIP、ChIP、雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)（云序可提供以上服務(wù)）
實(shí)驗(yàn)樣本：淋巴轉(zhuǎn)移膀胱癌組織vs.非淋巴轉(zhuǎn)移膀胱癌組織（5 vs. 5 ）
文獻(xiàn)鏈接：
https://www.jci.org/articles/view/130892/pdf

文章內(nèi)容 

（1）LNMAT2過(guò)表達(dá)與BCa淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)

作者前期通過(guò)對(duì)5對(duì)淋巴轉(zhuǎn)移膀胱癌組織（LN+）和非淋巴轉(zhuǎn)移膀胱癌組織（LN-）進(jìn)行LncRNA-seq（云序可提供此服務(wù)）發(fā)現(xiàn)，LNMAT2在淋巴轉(zhuǎn)移膀胱癌（Bca）組織明顯上調(diào)；對(duì)266名膀胱癌組織進(jìn)行qPCR，結(jié)果顯示LNMAT2在LN+中明顯上調(diào)；K-M分析顯示，LNMAT2過(guò)表達(dá)的膀胱癌病人生存率（OS）和無(wú)病生存率（DFS）明顯少于低表達(dá)LNMAT2組。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明LNMAT2過(guò)表達(dá)可能引起B(yǎng)Ca的LN轉(zhuǎn)移。

圖注：LNMAT2過(guò)表達(dá)與BCa淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)

（2）LNMAT2在BCa細(xì)胞分泌的外泌體中富集

作者利用ISH實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在BCa的胞外間隙中有較高的LNMAT2表達(dá)（D）；與LN（-）-BCa組織相比，LN（+）-BCa組織中細(xì)胞外LNMAT2的表達(dá)明顯升高。細(xì)胞外lncRNA主要被包裹在特定的亞細(xì)胞物質(zhì)中（特別是外泌體），提示LNMAT2可能被BCa細(xì)胞外泌體包裹。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，作者從206例BCa患者和120例健康對(duì)照組的尿液樣本中分離出外泌體并進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)與健康對(duì)照組相比，來(lái)自BCa患者的尿液外泌體中LNMAT2表達(dá)上調(diào)。這提示外泌體LNMAT2對(duì)BCa的發(fā)生發(fā)展有重要意義。 

圖注：LNMAT2在BCa細(xì)胞分泌的外泌體中富集

（3）BCa細(xì)胞分泌的外泌體LNMAT2在體外促進(jìn)淋巴生成

作者首先對(duì)BCa細(xì)胞系（5637和UM-UC-3）進(jìn)行外泌體鑒定；下調(diào)/過(guò)表達(dá)LNMAT2的BCa細(xì)胞系外泌體與人淋巴內(nèi)皮細(xì)胞（HLEC）共孵育，血管形成實(shí)驗(yàn)和遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)下調(diào)LNMAT2能夠抑制HLEC的血管形成和遷移，上調(diào)LNMAT2則相反；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明，上調(diào)LNMAT2能促進(jìn)淋巴生成。

圖注：BCa細(xì)胞分泌的外泌體LNMAT2在體外促進(jìn)淋巴生成

（4）hnRNPA2B1介導(dǎo)LNMAT2包裝進(jìn)入BCa細(xì)胞外泌體

為了探究LNMAT2的分子機(jī)制，作者進(jìn)行LNMAT2 RNA pull-down+MS（云序可提供此服務(wù)）實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示hnRNPA2B1能夠與LNMAT2直接結(jié)合；為了驗(yàn)證MS結(jié)果，作者進(jìn)行LNMAT2 RNA pull-down+WB、RIP+qPCR（云序可提供此服務(wù)）實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示LNMAT2確實(shí)能夠與hnRNPA2B1直接結(jié)合；而且FISH實(shí)驗(yàn)顯示LNMAT2和hnRNPA2B1能夠定位于細(xì)胞核；為了探究LNMAT2是如何進(jìn)入BCa細(xì)胞外泌體的，作者在BCa細(xì)胞系中敲減hnRNPA2B，發(fā)現(xiàn)外泌體中LNMAT2的表達(dá)降低。這些結(jié)果說(shuō)明hnRNPA2B1能夠介導(dǎo)LNMAT2包裝進(jìn)入BCa細(xì)胞外泌體。   

圖注：hnRNPA2B1介導(dǎo)LNMAT2包裝進(jìn)入BCa細(xì)胞外泌體

（5）外泌體LNMAT2上調(diào)PROX1的表達(dá)

有研究報(bào)道，PROX1通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的分化和轉(zhuǎn)移，對(duì)淋巴管系統(tǒng)發(fā)育至關(guān)重要。因此作者通過(guò)qPCR和WB實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HLECs中上調(diào)LNMAT2能夠促進(jìn)PROX1的表達(dá)；為了探究LNMAT2調(diào)控PROX1表達(dá)的分子機(jī)制，作者進(jìn)行核質(zhì)分離PCR，發(fā)現(xiàn)LNMAT2主要存在于HLECs的細(xì)胞核中；為了探究LNMAT2是否參與啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，作者針對(duì)PROX1上游-2000 bp到下游+200bp分區(qū)間進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)（云序可提供此服務(wù)），結(jié)果顯示PROX1在-650bp到-350bp區(qū)間的熒光值明顯升高，說(shuō)明該區(qū)域能夠與LNMAT2結(jié)合。

圖注：外泌體LNMAT2上調(diào)PROX1的表達(dá)

（6）外泌體LNMAT2與hnRNPA2B1互作促進(jìn)PROX1啟動(dòng)子區(qū)H3K4三甲基化

研究發(fā)現(xiàn)，hnRNPA2B1能夠通過(guò)與目標(biāo)DNA結(jié)合參與H3K4三甲基化（H3K4me3）相關(guān)的表觀遺傳調(diào)控。為了探究hnRNPA2B1是否也具有類似功能，作者通過(guò)ChIP實(shí)驗(yàn)（云序可提供此服務(wù)）驗(yàn)證，在LNMAT2過(guò)表達(dá)的HLECs中，hnRNPA2B1與H3K4me3都與PROX1啟動(dòng)區(qū)結(jié)合能力增強(qiáng)，反之亦然；這說(shuō)明外泌體LNMAT2通過(guò)與hnRNPA2B1直接互作提高PROX1啟動(dòng)子中H3K4me3的水平。

圖注：外泌體LNMAT2與hnRNPA2B1互作促進(jìn)PROX1啟動(dòng)子區(qū)H3K4三甲基化

（7）外泌體LNMAT2誘導(dǎo)PROX1上調(diào)促進(jìn)淋巴淋巴轉(zhuǎn)移

為了明確PROX1是否為BCa外泌體LNMAT2誘導(dǎo)淋巴管生成所必需的，作者進(jìn)行了PROX1挽救實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)PROX1過(guò)表達(dá)能夠回補(bǔ)外泌體LNMAT2過(guò)表達(dá)導(dǎo)致的抑制HLEC血管形成和遷移現(xiàn)象；相反，PROX1沉默明顯消除了外泌體LNMAT2誘導(dǎo)的HLEC血管形成和遷移現(xiàn)象。

圖注：外泌體LNMAT2誘導(dǎo)PROX1上調(diào)促進(jìn)淋巴轉(zhuǎn)移

（8）外泌體LNMAT2與BCa患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)

研究證明，BCa細(xì)胞分泌的外泌體lncRNA可以在尿液中檢測(cè)到，并且這些尿液外泌體lncRNA被認(rèn)為可以作為早期診斷BCa的生物標(biāo)志物，作者對(duì)另外206例BCa患者尿液外泌體進(jìn)行qPCR，結(jié)果顯示LNMAT2在LN（+）BCa中明顯上調(diào)；KM分析顯示尿液外泌體LNMAT2高表達(dá)BCa患者的OS 和DFS是降低的；ROC曲線分析顯示尿外泌體LNMAT2可以作為BCa和LN（+）BCa診斷的生物分子標(biāo)志物。

圖注：外泌體LNMAT2與BCa患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)

總結(jié)

總體來(lái)說(shuō)，該研究通過(guò)LncRNA-seq（云序可提供此服務(wù)）篩選了在淋巴轉(zhuǎn)移的膀胱癌中上調(diào)的LNMAT2，并通過(guò)原位雜交實(shí)驗(yàn)將LNMAT2與膀胱癌外泌體聯(lián)系在一起，并巧妙利用了RNA pull-down+MS/WB、RIP、ChIP以及雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)等方法（云序可提供以上服務(wù)），探究hnRNPA2B1介導(dǎo)LNMAT2進(jìn)入膀胱癌外泌體中，外泌體LNMAT2被人淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞攝取內(nèi)化后，通過(guò)募集hnRNPA2B1和增加PROX1啟動(dòng)子上的H3K4三甲基化水平，進(jìn)一步上調(diào)PROX1表達(dá)，最終導(dǎo)致淋巴管生成和淋巴轉(zhuǎn)移。這為研究和理解生物體復(fù)雜的外泌體調(diào)控機(jī)制，提供了比較完整的實(shí)驗(yàn)研究思路和方案，具有很強(qiáng)的理論先導(dǎo)性和示范性，也為疾病的調(diào)控和靶點(diǎn)提供了重要的理論依據(jù)。

圖注：膀胱癌外泌體LNMAT2調(diào)控淋巴轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制

云序生物作為以高通量測(cè)序技術(shù)為依托的科研服務(wù)公司，擁有豐富的微量樣本測(cè)序經(jīng)驗(yàn)，為眾多臨床與基礎(chǔ)科研研究者提供了高質(zhì)量的科研服務(wù)，助力客戶發(fā)表過(guò)眾多微量樣本的SCI文章，其中包含多篇外泌體文章。云序生物提供從外泌體提取、外泌體鑒定、外泌體全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、RIP、RNA pull-down和雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)等一站式服務(wù)，協(xié)助用戶實(shí)現(xiàn)快速發(fā)表外泌體成果。