TissueFAXS Cytometry技術(shù)在新冠肺炎相關(guān)方向研究

2月17日，上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院新冠肺炎病因診斷專家組踏上征程。該專家組由國家衛(wèi)健委委派，赴武漢開展新冠肺炎病理學和病因診斷研究工作。他們的主要任務(wù)是進行新冠肺炎病例的病因分析，深入研究疾病發(fā)生發(fā)展的病理生理過程，并為后續(xù)研究提供重要科學支撐。與此同時，全國首批新冠肺炎逝者遺體解剖也已在武漢金銀潭醫(yī)院完成。

為什么病理學信息至關(guān)重要？

目前，臨床上對于新冠肺炎的了解和認知大都來源于臨床癥狀、影像學、檢驗分析、病毒分析等方面研究。但要真正直觀地了解器官的損傷、如何損傷、體內(nèi)器官損傷如何相互關(guān)聯(lián)影響等問題，都需要通過病理學信息來解決。

病理學家指出，「對于新冠肺炎而言，通過病理解剖研究疾病發(fā)生機理，有助于幫助臨床糾正可能的錯誤診療方案。此外，超微結(jié)構(gòu)、分子病理等方面研究也可以幫助其他領(lǐng)域的專家做很多事情�！�

COVID-19患者的病理學特征 SARS-CoV-2感染患者的雙肺、肝臟及心臟組織病理標本（Zhe Xu, Lei Shi, Yinjin Wang.etal. Pathological findings of COVID-19 associated with acuterespiratory distresssyndrome. Lancet Respir Med 2020）

根據(jù)解剖完成的肺組織切片鏡下可見，COVID-19的患者存在彌漫性的肺泡損傷，伴有支氣管上皮剝脫、纖毛脫落、鱗狀上皮化生等病變；以及肺泡壁大量的炎性滲出，導致患者呼吸困難、血氧含量降低。死者大部分肺泡和肺間質(zhì)巨噬細胞浸潤、肺泡上皮細胞增生，形成雙嗜性胞漿豐富的多核巨細胞。

病理學信息是重大疾病確診的最終診斷標準，組織圖像中細胞不是獨立存在的，而是交織、混雜在一起，同種細胞形態(tài)上有時也會存在較大差異，要想做到組織圖像中每個單細胞標記marker的準確量化、準確的單細胞識別是后續(xù)量化的基礎(chǔ)。TissueFAXS Cytometry專利的單細胞識別技術(shù)，可以做到組織內(nèi)不同大小、染色強度、形態(tài)等差異性非常大的細胞核、質(zhì)、膜多組分準確識別，保證細胞統(tǒng)計準確性，為后續(xù)量化分析奠定了堅實基礎(chǔ)。

TG & COVID-19

奧地利TissueGnostics公司的TissueFAXS Cytometry專利技術(shù)是一種基于全景組織細胞定量分析系統(tǒng)的圖像處理的病理定量分析技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)包括超大尺寸病理切片全景掃描和細胞培養(yǎng)樣本的數(shù)字化全息獲�。粡膩喖毎�到組織水平的大數(shù)據(jù)定量分析；目標細胞/組織/結(jié)構(gòu)空間分布水平數(shù)字化定量以及完成從體視學到大數(shù)據(jù)的雙向獨立、可重復的驗證。 針對新冠肺炎的研究，TissueFAXS Cytometry技術(shù)具有極大的應(yīng)用意義。
 

1. HE／IHC樣本組織：自動對簡單HE染色下肺組織中所有細胞輪廓進行識別，結(jié)合自動肺泡/支氣管的組織識別功能，迅速判斷炎性細胞數(shù)量、浸潤程度、上皮脫落面積、纖維化程度等指標。
2. IF樣本組織：結(jié)合標記特異性蛋白Marker的免疫組化或免疫熒光技術(shù)，可以更進一步研究肺組織微環(huán)境中浸潤的免疫細胞表型、上皮細胞化生程度等實驗室精準定量指標。
3. 病毒原位研究：利用特異性核酸熒光探針以及免疫熒光技術(shù)，共同標記病毒相關(guān)蛋白的表面抗原及核酸核心，不但可以從圖像中精準定量病毒在細胞內(nèi)外的數(shù)量及位置 — 建立通中過肉眼可以判斷的病毒載量定量標準，同時分析病毒的增殖侵襲過程和組織的相互空間關(guān)系！

TissueFAXS Cytometry技術(shù)相關(guān)案例1

無標記形態(tài)學識別及定量分析肺組織中的支氣管/血管/肺泡
 
通過顏色及形態(tài)學參數(shù)，在識別肺泡細胞/支氣管上皮細胞/血管內(nèi)皮細胞/紅細胞的基礎(chǔ)上，對無特殊染色標記的肺組織中支氣管、血管、肺泡的數(shù)量/大小/形態(tài)進行定量分析。

TissueFAXS Cytometry技術(shù)相關(guān)案例2

HE染色下自動識別并定量肺腫瘤/血管/炎性滲出區(qū)域/正常肺泡區(qū)域 根據(jù)肺部腫瘤、炎性細胞等組織的顏色及形態(tài)學特性，對無特殊染色標記的組織病灶及結(jié)構(gòu)進行識別，并用不同顏色標記以便進行后續(xù)的定量分析。

TissueFAXS Cytometry技術(shù)支持超大組織樣本切片全景掃描和定量分析，協(xié)助科研工作者們突破從分子水平、細胞水平、組織水平直至器官水平的數(shù)據(jù)瓶頸，分析不同分子/蛋白在不同組織內(nèi)部及相鄰器官中的數(shù)量、形態(tài)、類型、分布等信息，從微米尺度到厘米尺度，真正做到100％還原原始樣本！

TG在病毒分子機制研究中的應(yīng)用發(fā)表文章節(jié)選

• 流行性感冒和肺炎的分子機制研究 （日本東北大學醫(yī)學研究院）

致死性流感肺炎的嚴重程度取決于OX40L表達。由于OX40L能夠與細支氣管肺泡干細胞的流感病毒相結(jié)合，流感感染時通過增加細胞數(shù)量以介導上皮修復，并誘導其表面的OX40L表達從而刺激免疫反應(yīng)。然而，宿主的防御反應(yīng)將會導致更廣泛的感染，最終造成過度的免疫防御反應(yīng)而致死。
F，G： 對比致死劑量的A / H1N1流感病毒（Flu）和生理鹽水（Mock）氣管內(nèi)感染的WT小鼠肺細支氣管的免疫熒光樣本，因為CCSP（紅色）和SPC（綠色）雙陽性表達被認為是細支氣管肺泡干細胞的特征，用來反映支氣管肺泡干細胞的存在與否。

由TissueFAXS系統(tǒng)掃描的影像數(shù)據(jù)進行定量分析得出，甲流病毒的感染使終末細支氣管CCSP免疫反應(yīng)性細胞的脫落，但CCSP/SPC雙陽性細胞則更多的在遠端支氣管部位出現(xiàn)，修復受損的上皮。

• AXL受體-星形膠質(zhì)細胞反應(yīng)相關(guān)研究（上海復旦大學附屬金山公共衛(wèi)生臨床中心）

​ 細胞膜表面分子AXL在寨卡病毒（Zika virus, ZIKV）染星形膠質(zhì)細胞的過程中扮演著重要角色，但它并不是ZIKV進入星形膠質(zhì)細胞的主要受體，AXL分子主要通過STAT1/STAT2通路調(diào)控SOCS1分子表達，進而抑制I型干擾素信號應(yīng)答，最終促進ZIKV在宿主細胞中復制。該研究發(fā)現(xiàn)的ZIKV感染神經(jīng)細胞的新機制，為研發(fā)新型有效的ZIKV防御技術(shù)提供了生物學新靶點。 b,c：ISH法檢測ZIKV RNA，并對內(nèi)部的ZIKV RNA進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析g,h：AXL基因敲除介導的ZIKV復制能力受到IFNAR1信號通路控制，IFNAR信號依賴機制可以有效保護星形膠質(zhì)細胞

病毒分離鑒定十分復雜，利用StrataQuest軟件對免疫熒光、原位雜交的掃描圖像進行分析，獨有的細胞質(zhì)形態(tài)識別功能，可以十分清晰的看到病毒的復制數(shù)量、作用靶點以及空間分布位置，為明確病毒感染細胞的作用機制提供有效的幫助。

• HIV/SIV及結(jié)核病的相關(guān)性研究（美國麻省理工學院，哈佛醫(yī)學院）

研究人員對人肺組織、人源化小鼠CD4+T細胞以及結(jié)核分枝桿菌（Mtb）/ 猴免疫缺陷病毒（SIV）非人靈長類共感染模型中的感染情況進行研究，表明肺實質(zhì)CD4+T細胞對HIV-1依賴性細胞死亡具有耐受性，而CD4+T細胞在肺間質(zhì)而不是肺泡腔中的缺失非常顯著，CD4+T細胞的缺失與肺外播散有關(guān)，研究還證明了肺間質(zhì)CD4+T細胞是HIV-1和SIV感染的有效靶點，使得其早期衰竭缺失和播散性肺結(jié)核的風險增加。 實驗人員對肺部及脾臟組織的CD4+T IHC切片進行組織原位掃描明確感染部位及CD4+的分布情況并對CD4+細胞進行定量分析，發(fā)現(xiàn)CD4 + T細胞高度允許HIV-1誘導的細胞死亡而HIV-1感染不會明顯改變肺泡CD4 + T細胞數(shù)量。但是，SIV感染導致肺結(jié)核期間間質(zhì)CD4 +T細胞耗竭并進一步證實出肺間質(zhì)CD4 + T細胞丟失與播散性結(jié)核有關(guān)。

嚴謹?shù)目茖W研究需要客觀、量化的數(shù)據(jù)支持，針對于肺部等組織免疫細胞的數(shù)量關(guān)系、空間位置分布情況以及相互作用關(guān)系，TissueFAXS Cytometry技術(shù)可以提供組織原位精準定量的數(shù)據(jù)結(jié)果，將極大的推動研究者們的科研進展。