（ 一） 前言

哮喘、 克羅恩病和高血壓是分別影響氣管、 腸道和血管的慢性疾病， 都和管狀器官的過
度收縮有關(guān)。 為使氣道或血管收縮， 平滑肌細(xì)胞（ smooth muscle cells， SM cells） 之間
會通過互相聯(lián)系， 產(chǎn)生連接通路進(jìn)行力的傳遞， 引起器官的收縮反應(yīng)。 目前， 我們對此連接
通路的機(jī)制知之甚少。

2018 年， 美國東北大學(xué)和哈佛醫(yī)學(xué)院的學(xué)者們利用法國 Alveole 公司的 PRIOM“ 定制
化細(xì)胞微環(huán)境制備系統(tǒng)” 創(chuàng)建了 2 個平滑肌細(xì)胞的互相作用模型， 對細(xì)胞-細(xì)胞連接通路和
細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)（ ECM） 連接通路進(jìn)行了研究， 取得了一系列的成果【 1】 ：

結(jié)論 1： ECM 的剛度是一個開關(guān)， 當(dāng)它達(dá)到某一個值的時候， 平滑肌力通過 ECM 傳導(dǎo)，
在這個值以下的時候， 通過細(xì)胞-細(xì)胞間連接傳導(dǎo)。

結(jié)論 2： 隨著 ECM 剛度的增加， 粘附連接（ adherens junctions)和黏著斑連接（ focal
adhesions） 的熒光圖像顯示， 細(xì)胞-細(xì)胞間界限逐漸消失， 粘附連接減少， 而黏著斑連接出
現(xiàn)。

結(jié)論 3： 在相同的 ECM 剛度下， ECM 傳導(dǎo)的收縮力也大于細(xì)胞-細(xì)胞間連接傳導(dǎo)的收縮力。
這些成果有助于對哮喘和高血壓等疾病的進(jìn)一步研究。

（ 二） 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.1 為什么要用 Alveole PRIMO？

要研究 ECM 剛度和 SM 細(xì)胞間力的傳遞的關(guān)系， 就要創(chuàng)建一個 SM 細(xì)胞模型， 具有可調(diào)節(jié)
剛度的基質(zhì)， 并能度量細(xì)胞-細(xì)胞之間， 和細(xì)胞-ECM 之間的作用力。 傳統(tǒng)方法設(shè)計(jì)的細(xì)胞模
型缺點(diǎn)很多： 如分辨率不夠、 設(shè)計(jì)不靈活、 很難對材質(zhì)進(jìn)行功能化改造、 耗時長、 人工操作
繁瑣， 等。 因此， 科學(xué)家選擇了創(chuàng)新型的全自動的 Alveole PRIMO“ 定制化細(xì)胞微環(huán)境制備
系統(tǒng)” 來創(chuàng)建這個細(xì)胞作用力模型； 并通過改變 ECM 剛度， 檢測“ 細(xì)胞收縮力” ； 確定“ 粘
附連接” 和“ 黏著斑連接” 之間轉(zhuǎn)換的 ECM 剛度數(shù)值。

2.2 用 PRIMO 進(jìn)行細(xì)胞模型設(shè)計(jì)

科學(xué)家用 PRIMO 在二甲基硅氧烷（ PDMS） 基質(zhì)上設(shè)計(jì)了一個長方形的明膠塊， 再在上面
種植了 2 個相鄰的氣道平滑�。� ASM） 細(xì)胞形成作用力模型。
科學(xué)家精心挑選了 NuSil 作為 PDMS， 關(guān)鍵是因?yàn)檫@種透明無孔的材料的剛度可以在
E=300Pa-40kPa 間調(diào)整。 NuSil 剛度 E=300Pa 時可以模擬健康人氣管的 ECM， 而 E=13kPa 和
E=40kPa 時用來模擬改造后的 ECM。 改變 NuSil 剛度， 就可以模擬不同剛度的 ECM， 從而判
斷 ECM 剛度和收縮力傳導(dǎo)通路間的關(guān)系。

實(shí)驗(yàn)方法采取的是： 基質(zhì)的表面功能化（ Micropatterning） ， 步驟如圖 1 所示： 圖 1. 用 PRIMO 進(jìn)行 Micropatterning 的實(shí)驗(yàn)過程：
圖 A、 圖 B： 將 NuSil 旋轉(zhuǎn)涂布在玻璃蓋玻片上， 在其表面創(chuàng)造出一層均勻的 NuSil 凝膠層。
圖 C： NuSil 材料在 60℃下烘烤過夜， 重復(fù)以上步驟在 NuSil 上加上一層薄的均勻的熒光微
珠層。
圖 D、 圖 E： 接上聚-L-賴氨酸（PLL） 和 mPEG-SVA， 后者在 PLL 上形成酰胺基團(tuán)， 阻止細(xì)胞
粘附在 PLL 上。
圖 F： 加入光引發(fā)劑 PLPP， 用 PRIMO 投射 UV 光（λ =375nm） 到 NuSil 凝膠的表面， 快速降解暴露在 UV 光下的 PLL-PEG 覆蓋層， 產(chǎn)生一個 15µm× 150µm 的長方形微圖案。
圖 G： 將其與 0.1%明膠（加上 ECM 蛋白） 孵育 1h， 用 PBS 洗滌后， 明膠僅僅保留在長方形
微圖案區(qū)域。
圖 H： 生成的長方形的帶熒光的明膠圖案。

最后， 涂布 ECM 蛋白的 NuSil 凝膠在紫外滅菌后種上“原代人氣管平滑肌細(xì)胞” （HASMCs） ，
細(xì)胞僅粘附在微圖案上， 形成互相接觸的 2 個細(xì)胞的作用力模型。

2.3 實(shí)驗(yàn)控制變量及設(shè)計(jì)

“基質(zhì)剛度” 調(diào)節(jié)： NuSil 凝膠由 A 部分和 B 部分原料混合得到， B 部分（交聯(lián)劑） 的
占比可調(diào)節(jié)最終的基質(zhì)的剛度（在 Young’ s modulus E=300Pa-40kPa 范圍內(nèi)） 。
“細(xì)胞收縮力” 檢測： NuSil 表面涂布的熒光微珠的直徑是 1µm， 通過顯微鏡觀察熒光
微珠的運(yùn)動， 用傅里葉牽引力顯微術(shù)（Fourier Traction Force Microscopy） 和 MATLAB
軟件程序計(jì)算得到細(xì)胞收縮力大小。
“粘附連接” 和“黏著斑連接” 的觀察： β -連環(huán)蛋白（β -catenin） 是細(xì)胞-細(xì)胞間
粘附連接（adherens junctions)的標(biāo)志物， 可染成紅色； 而黏著斑蛋白（vinculin） 是細(xì)
胞-ECM 間黏著斑連接（focal adhesions） 的標(biāo)志物， 可染成綠色。 細(xì)胞用 4%甲醛固定后，
同時針對β -連環(huán)蛋白和黏著斑蛋白進(jìn)行染色， 用熒光成像觀察這兩種標(biāo)志物蛋白， 從而判
斷細(xì)胞間連接的類型（圖 2） 。

在相同基質(zhì)剛度下， “細(xì)胞-細(xì)胞間有無連接” 會影響“收縮時刻” ： “有連接的細(xì)胞
對” 用圖 1 方法創(chuàng)建， “相鄰又無連接的細(xì)胞組合” ： 建立新的細(xì)胞模型： 在微圖案上只種
上一顆單獨(dú)的細(xì)胞， 再把這兩個微圖案同方向連接在一起， 細(xì)胞間相鄰卻無相互作用。 將“細(xì)
胞對” 和“細(xì)胞組合” 的收縮時刻（contractile moment）（可理解為收縮力度， contractile
strength） 進(jìn)行對比。

（三） 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論

3.1 “ 粘附連接” 和“ 黏著斑連接” 的觀察

在細(xì)胞水平， 平滑肌（ SM） 細(xì)胞可通過鈣粘蛋白（ cadherin） 介導(dǎo)的粘附連接和臨近的
細(xì)胞直接聯(lián)系； 它們也可以通過整聯(lián)蛋白（ integrin） 介導(dǎo)的黏著斑連接和 ECM 作用， 通過
ECM 和遠(yuǎn)距離的其他 SM 細(xì)胞進(jìn)行間接的聯(lián)系。



圖 2-1.“ 粘附連接” 和“ 黏著斑連接” 的觀察：

圖 A： 剛度為 E=300Pa 的 NuSil 基質(zhì)可用來模擬健康的人氣管的細(xì)胞外基質(zhì)（ ECM） ， 此時
ASM 細(xì)胞交界處清楚地顯示紅色的β -連環(huán)蛋白（ 細(xì)胞-細(xì)胞間粘附連接（ adherens junction)
的標(biāo)志物， 紅色） ， 說明形成穩(wěn)定的細(xì)胞-細(xì)胞連接。

圖 B： 模擬重新建模的剛性更強(qiáng)的 ECM， E =13kPa-40kPa， 當(dāng) ECM 剛性增強(qiáng)到 13kPa 時， 可以看出細(xì)胞交界處出現(xiàn)了綠色的黏著斑蛋白（ 細(xì)胞-ECM 間黏著斑連接(focal adhesion)的
標(biāo)志物， 綠色， 黃色箭頭） ， 說明出現(xiàn)細(xì)胞-ECM 連接。

圖 C： 當(dāng) ECM 剛性增強(qiáng)到 40kPa 時， 細(xì)胞交界處的β -連環(huán)蛋白（ 紅色） 完全讓位給了黏著
斑蛋白（ 綠色， 黃色箭頭） ， 說明平滑肌力從“ 細(xì)胞-細(xì)胞之間傳導(dǎo)” 變成了“ 通過 ECM 傳
導(dǎo)” 。 兩個細(xì)胞完全分開。 圖 2-2. 圖 D： Y 軸是被黏著斑連接（ 綠色） 占據(jù)的面積， 隨基質(zhì)剛度增加而增加， 說明“ 通
過 ECM 傳導(dǎo)” 的通路連接增加。
圖 E： Y 軸是被粘附連接（ 紅色） 占據(jù)的面積， 隨基質(zhì)剛度增加而減少， 說明“ 通過細(xì)胞-
細(xì)胞之間傳導(dǎo)” 的通路連接減少。

科學(xué)家發(fā)現(xiàn)， 粘附連接區(qū)域的減少總是伴隨著黏著斑連接區(qū)域的增加。

3.2 “細(xì)胞-細(xì)胞間有無連接” 影響“收縮時刻”

收縮時刻表示的是收縮力度， “有連接的細(xì)胞對” 間存在粘附連接， 而“相鄰又無連接
的細(xì)胞組合” 間只存在與 ECM 的黏著斑連接。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明： 即使在相同的基質(zhì)剛度下， 細(xì)
胞-ECM 間黏著斑連接的收縮力度也要高于細(xì)胞-細(xì)胞間粘附連接的收縮力度； 細(xì)胞-細(xì)胞間
連接極大地減少了 SM 細(xì)胞的整體的收縮力（圖略） 。 隨著基質(zhì)剛度增加， 粘附連接減弱，
每個 ASM 細(xì)胞與 ECM 的作用增強(qiáng)， 收縮時刻（收縮力度） 也明顯增加。

3.3 其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果

其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果包括： 隨著基質(zhì)剛度的增加， ASM 細(xì)胞對的收縮時刻（收縮力度） 增加；
ASM 細(xì)胞對連接部位的牽引力增加； 細(xì)胞-細(xì)胞間作用力強(qiáng)度（Ψ） 減弱（圖略） 。

3.4 實(shí)驗(yàn)展望

目前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是細(xì)胞種類依賴性的， 如心肌細(xì)胞就有不同的結(jié)論（細(xì)胞-細(xì)胞間作用
隨基質(zhì)剛性增加而增加） 。 本文只研究了 2 個平滑肌細(xì)胞在收縮刺激下的反應(yīng)， 后續(xù)科學(xué)家
還會進(jìn)一步研究其在同時有收縮刺激和舒張刺激下的反應(yīng)， 和多個平滑肌細(xì)胞的相互作用，
更好地模擬體內(nèi)生理環(huán)境。

（四） 關(guān)于 Alveole PRIMO

4.1 PRIMO 的運(yùn)行原理
  圖 3. 左圖： 選擇電腦中任意一張圖案， 在 LEONARDO 軟件作用下， 用 PRIMO 進(jìn)行非接觸式、
無掩模 UV 投射和蝕刻。 PRIMO 模塊和大多數(shù)倒置顯微鏡兼容。 右圖： PRIMO 通過控制 DMD
（Digital Micromirror Device） ， 即 DLP chip 的微型鏡片的開合狀態(tài)， 控制投射在細(xì)胞
基質(zhì)上的紫外激光的照射強(qiáng)度、 照射時間和照射區(qū)域， 按照圖案進(jìn)行靈活蝕刻【2】 。
PRIMO 的 Micropatterning 的實(shí)驗(yàn)原理可參考： 生物建模的黑科技——快捷精準(zhǔn)的“定
制化細(xì)胞微環(huán)境制備系統(tǒng)” （上） 。

4.2 PRIMO 的主要特點(diǎn)和優(yōu)勢 ：

 無掩模： 非接觸式、 無掩模 UV 投射成像（波長λ =375nm） ， 可靈活控制 UV 的強(qiáng)度、 照
射時間、 區(qū)域；
 自動化： 全自動快速定制， 可針對實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行快速優(yōu)化；
 高靈活性： 可按照任意圖案去構(gòu)建您的基質(zhì)和/或使其功能化， 不限圖案的大小和復(fù)雜
程度， 生成不同的細(xì)胞模型；
 多樣性/兼容性： 適用于常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)， 基質(zhì)可為平面或有微結(jié)構(gòu)， 可硬可軟，
如： 玻璃蓋玻片、 塑料培養(yǎng)皿、 聚二甲基硅氧烷（PDMS） 、 聚苯乙烯、 水凝膠（PEG 丙
烯酸酯、 聚丙烯酰胺凝膠、 瓊脂、 基質(zhì)膠） 、 光刻膠， 等；
 常 用 蛋 白 ： 我 們 的 客 戶 日 常 使 用 超 過 10 種 的 各 類 蛋 白 ： Fibrinogen-488,
Fibrinogen-647, Fibronectin, GFP, Neutravidin-488, Neutravidin-647,
PLL-PEG-Biotin, Protein A-647, Streptavidin, 初級和次級抗體， 等；
 高分辨率： 全視野分辨率為 1.2µm（500× 300µm ， 20 倍物鏡） ；
 多層次： 可蝕刻 256 個灰階層次， 粘附不同密度層次的蛋白；
 多種蛋白： 可應(yīng)用 3 種不同蛋白（根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求） ；
 自動對齊： 自動進(jìn)行檢測和圖案定位， 可自動對齊于微結(jié)構(gòu)或者微圖案上；
 速度快： 蝕刻 500× 300µm 圖案， 20 倍物鏡， 僅需 30s。
PRIMO 強(qiáng)大的生物建模能力和對細(xì)胞微環(huán)境的控制， 可以為多種生物學(xué)實(shí)驗(yàn)帶來全新
的、 突破性視角， 可用于研究細(xì)胞遷移/趨觸性、 細(xì)胞黏附、 2D/3D 細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)化培養(yǎng)、 細(xì)胞
球培養(yǎng)、 生物力學(xué)、 組織工程、 微流體等多個領(lǐng)域。

（五） 附錄

更多資訊， 請聯(lián)系： 森西科技有限公司， 電話： 010-61666616， 熱線: 400-687-6366，
郵箱： info@sinsitech.com， 網(wǎng)址： www.sinsitech.com。 掃描以下二維碼， 關(guān)注微信公眾
號， 獲得更多信息：