什么是數(shù)字PCR?
數(shù)字PCR是一種新的絕對(duì)定量PCR,通過對(duì)PCR反應(yīng)物進(jìn)行有限稀釋,隨后在不同的反應(yīng)腔室里進(jìn)行PCR擴(kuò)增,最后根據(jù)泊松分布原理及陽(yáng)性微滴的個(gè)數(shù)與比例得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度的技術(shù)。
什么是多重PCR?
多重PCR又稱多重引物PCR或復(fù)合PCR,它是在同一PCR反應(yīng)體系里加上兩對(duì)以上引物,同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的PCR反應(yīng);由Chambehian'于1988年首次提出,其反應(yīng)原理,反應(yīng)試劑和操作過程與一般PCR相同。理論上只要PCR擴(kuò)增的條件合適,引物對(duì)的數(shù)量可以不限,但由于各種條件的限制,實(shí)際能夠擴(kuò)增的引物對(duì)數(shù)量是有限的。
什么是多重?cái)?shù)字PCR?
多重?cái)?shù)字PCR是在同一數(shù)字PCR反應(yīng)體系里加上兩對(duì)或兩對(duì)以上引物,同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的數(shù)字PCR反應(yīng)。將多重PCR技術(shù)與數(shù)字PCR技術(shù)有機(jī)結(jié)合而形成的多重?cái)?shù)字PCR,根據(jù)DNA探針不同熒光度、DNA擴(kuò)增不同循環(huán)數(shù)及多種標(biāo)記熒光同時(shí)使用,便可大幅提高數(shù)字PCR多重性,多重性可達(dá)20-50以上,即同時(shí)在一個(gè)PCR反應(yīng)單元內(nèi)進(jìn)行20-50個(gè)以上的數(shù)字PCR反應(yīng)。
多重?cái)?shù)字PCR在醫(yī)學(xué)檢測(cè)中的優(yōu)勢(shì)
在數(shù)字PCR中實(shí)現(xiàn)多指標(biāo)的并行檢測(cè)能顯著降低檢測(cè)成本,獲取更豐富的檢測(cè)信息。在一個(gè)PCR反應(yīng)中完成基因多個(gè)突變位點(diǎn)的檢測(cè),即一個(gè)PCR反應(yīng)即可完成一個(gè)Panel的檢測(cè),在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著不可替代的優(yōu)勢(shì)。
其優(yōu)勢(shì)可以簡(jiǎn)單概括為以下三點(diǎn):
1高效性。
在同一PCR反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)檢出多種核酸片段,或?qū)τ卸鄠(gè)型別的目的基因進(jìn)行分型,特別是用一滴血就可檢測(cè)多種病原體。
2系統(tǒng)性。
多重?cái)?shù)字PCR很適宜于成組核酸片段的檢測(cè),如肝炎病毒,腸道致病性細(xì)菌,性病,無芽胞厭氧菌。
3經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便性。
多種核酸片段在同一反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)檢出,節(jié)省時(shí)間、試劑耗材和經(jīng)費(fèi),為臨床提供更多更準(zhǔn)確的檢測(cè)信息。
多重?cái)?shù)字PCR的檢測(cè)類型
數(shù)字PCR的多重檢測(cè)主要通過以下兩種方式實(shí)現(xiàn):
1、多個(gè)熒光通道。使用多種熒光染料來標(biāo)記不同的要檢測(cè)的靶基因。
2、單波長(zhǎng)多強(qiáng)度。使用一種熒光染料,但是擴(kuò)增結(jié)束時(shí)不同的靶基因?qū)?yīng)的染料的熒光強(qiáng)度不一樣。
多重?cái)?shù)字PCR在臨床領(lǐng)域的應(yīng)用舉例:
1.多重?cái)?shù)字pcr技術(shù)檢測(cè)肺癌EGFR基因突變
來源:Mol Med Rep.2017 Aug;16(2):1157–1166
EGFR基因突變位點(diǎn)的檢測(cè)是指導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌患者臨床用藥的依據(jù)。其中最常見的是21號(hào)外顯子L858R突變,19號(hào)外顯子缺失以及20號(hào)外顯子T790M突變。但是臨床樣本往往是有限的,尤其是液態(tài)活檢樣本,因此多重檢測(cè)可以節(jié)省大量檢測(cè)樣本及檢測(cè)成本。
2,多重?cái)?shù)字pcr技術(shù)在染色體非整倍體篩查中的應(yīng)用
來源:Analyst.2019 Mar 25;144(7):2239-2247
High-Precision Chromosomal Copy Number Measurement using RainDrop®Digital PCR Application Notes
數(shù)字PCR技術(shù)具有單分子靈敏度和絕對(duì)定量的能力,能夠區(qū)分微小差異,很適合用來進(jìn)行無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)。由于胎兒游離DNA占孕婦外周血中游離DNA很小一部分,常規(guī)實(shí)驗(yàn)一對(duì)引物探針要想準(zhǔn)確分辨胎兒染色體倍數(shù)需要提高足夠多的模板(約41-252ng,胎兒DNA比例10%-4%),這么大量的DNA臨床一般無法提供(1ml血常規(guī)只能獲得1-7ng cfDNA),這時(shí)通過多重?cái)?shù)字PCR設(shè)計(jì)40對(duì)引物和2個(gè)通用探針擴(kuò)增21號(hào)和18號(hào)染色體上的各20個(gè)片段,就能很好的解決這個(gè)問題。結(jié)果顯示以10ng cfDNA作為起始模板,使用多重?cái)?shù)字PCR技術(shù)能夠精準(zhǔn)分辨21-三體綜合征。
3.探針成本太高,沒關(guān)系我們用染料法也可以做多重?cái)?shù)字PCR
來源:Anal Chem.2013 Dec 3;85(23):11619-27
通過改變擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度,或者調(diào)整引物的量,或者改變反應(yīng)的Tm值等條件,可以輕松嘗試多重?cái)?shù)字PCR反應(yīng)。
4.染料法也可以檢測(cè)點(diǎn)突變
來源:Anal Chem.2014 Mar 4;86(5):2618-24
染料法也可以檢測(cè)SNP點(diǎn)突變,通過在上游引物末端添加一段序列,改變突變型或野生型擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度即可輕松實(shí)現(xiàn)多重檢測(cè)。
永諾MicroDrop®微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)更適合進(jìn)行多重PCR檢測(cè)
MicroDrop®是由廣東永諾醫(yī)療科技有限公司研發(fā)并投入生產(chǎn)的國(guó)產(chǎn)微滴式數(shù)字PCR檢測(cè)系統(tǒng),是我國(guó)首款擁有完全自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的微滴式數(shù)字PCR儀,20微升體系即可生成10萬微滴,F(xiàn)AM/VIC雙通道熒光檢測(cè),檢測(cè)靈敏度低至萬分之一。使用MicroDrop®微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)進(jìn)行四重PCR反應(yīng)同時(shí)檢測(cè)EGFR L858R和T790M突變,可以清晰的檢測(cè)到16群陽(yáng)性微滴,提高檢測(cè)靈敏度,節(jié)省臨床樣本。
廣州永諾生物
廣州永諾生物科技有限公司成立于2010年,總部位于廣州國(guó)際生物島,是一家專注于醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)開發(fā)與服務(wù)、分子診斷產(chǎn)品研發(fā)與生產(chǎn)的高新技術(shù)企業(yè)。公司目前占地面積近6000平方米,碩、博士以上學(xué)歷員工占比近40%,已建立包括基因組高通量測(cè)序、分子細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)、病毒包裝構(gòu)建和動(dòng)物疾病模型等在內(nèi)的一整套研發(fā)、生產(chǎn)技術(shù)體系平臺(tái)。
公司依托先進(jìn)的技術(shù)力量以及具有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)的人才儲(chǔ)備,建成符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心及常規(guī)分子實(shí)驗(yàn)平臺(tái)1000平方米、符合GMP標(biāo)準(zhǔn)的分子診斷試劑及產(chǎn)品車間2500平方米、醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室1000平方米、辦公場(chǎng)所1000平方米。并于2017年獲廣東省衛(wèi)生與計(jì)劃生育委員會(huì)批準(zhǔn)執(zhí)業(yè)第三方醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所—廣州永諾醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所,2018年獲得廣東省科技廳授予的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證。
廣東永諾醫(yī)療
廣東永諾醫(yī)療科技有限公司是永諾生物旗下的子公司,永諾生物以“中國(guó)智造”為己任,2017年10月永諾生物成功研發(fā)了國(guó)內(nèi)首款擁有完全自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)MicroDrop®并投入生產(chǎn),是國(guó)內(nèi)首款微滴式數(shù)字PCR檢測(cè)系統(tǒng)。目前數(shù)字PCR系統(tǒng)儀器及配套試劑、數(shù)字PCR腫瘤液體活檢試劑盒等正在申報(bào)醫(yī)療器械注冊(cè)證,能廣泛應(yīng)用于科研、醫(yī)療、出入境檢驗(yàn)檢疫等領(lǐng)域。
永諾醫(yī)療于2019年5月入駐佛山生命科學(xué)園,廠房面積達(dá)2500平方米,預(yù)計(jì)產(chǎn)能:年產(chǎn)200套儀器。