Drop-off數(shù)字PCR檢測方法的最主要優(yōu)勢是能夠能夠在一個反應(yīng)中檢測到基因組序列范圍短的同源基因突變（包括核苷酸的缺失，插入和替換）。簡單來講，Drop-off實驗包括兩個針對相同擴增子的TaqMan 探針：與野生型序列互補而與突變位點不發(fā)生互補的Drop-off探針和與突變型和野生型基因都互補的Reference探針（如圖1A）。在野生型等位基因的存在下，Drop-off 探針和Reference探針都將與目標雜交，產(chǎn)生雙重陽性信號（如圖1B，藍色群）。相反，如果存在突變的等位基因，即使一個核苷酸的突變也會阻止Drop-off探針與之雜交，因此只有Reference探針對目標基因進行退火，從而得到一個陽性信號。（如圖1B，綠色群）。

 

圖1信息說明如下：

A. Drop-off和Reference探針及引物在目標基因上的示意圖（FP：上游引物，RP：下游引物）

B. 2D圖中顯示來自雙陽性野生型等位基因的熒光簇（天藍色：藍色和綠色）和單一的突變等位基因的熒光簇（綠色）和陰性微滴簇（黑色）。

C. 值得注意的是在微滴生成過程中，某些突變等位基因和野生型等位基因隨機分布在同一液滴中，所以同一個液滴會同時顯示野生型和突變型（天藍色：藍色和綠色）。野生型濃度可以直接由雙色通道中的陽性液滴的比例獲得(第三個顏色通道的陰陽性微滴數(shù)不影響濃度計算)。突變型濃度可以直接單陽性微滴的比例獲得(第三個顏色通道的陰陽性微滴數(shù)不影響濃度計算)，其中已經(jīng)刨除了雙陽性液滴的數(shù)量。所以將雙陽性液滴計算為突變陰性微滴，突變頻率可能會被低估。

可以通過以下方式獲取Drop off計算方法：

www.stillatechnologies.com/technical-notes 或Whale,AS,et al.,Biomol Derect Quantif. 2016 27:10:15-23獲取Drop off計算方法的更多信息。

Drop-off檢測KRAS，NRAS和EGFR熱點突變

在臨床應(yīng)用中，通常檢測一組有預(yù)測意義的遺傳標記物跟蹤治療效果。例如：在非小細胞肺癌中，EGFR第19外顯子的缺失使其對第一代酪氨酸激酶抑制劑具有敏感性。在結(jié)直腸癌中，KRAS和NRAS原癌基因突變是EGFR抗體耐藥的重要指標。使用Drop-off和Naica三色多重檢測系統(tǒng)，設(shè)計了三種包含內(nèi)部質(zhì)控對照（IC，Internal Control）的Drop-off數(shù)字PCR檢測方法，用于檢測最常見的KRAS 3號外顯子、NRAS 2號外顯子和EGFR 19號外顯子的基因突變情況（如圖2,3）。增加內(nèi)部質(zhì)控品（IC）可以評估由于樣本中的抑制劑，從而評估方法的穩(wěn)定性。

圖2信息說明如下：

分別檢測7個和4個最常見的KRAS 12號外顯子和NRAS 3號外顯子突變，以及EGFR外顯子19缺失的Drop-off實驗可靠性。在25ul PCR反應(yīng)體系中，以95%的置信度在連續(xù)稀釋范圍從5%到0.25%的突變DNA中可以檢測到最終濃度為1cp/ul的突變DNA。所有檢測均在104copis的野生型DNA 和400copies的內(nèi)部質(zhì)控（來源于ØX174噬菌體）中進行，每個稀釋梯度進行了3次重復(fù)。所顯示的置信區(qū)間是理論置信區(qū)間的均值，該置信區(qū)間是在95%置信區(qū)間上由取樣誤差和分區(qū)誤差組成。

 

A：三重實驗中KRAS，NRAS和EGFR drop-off實驗2D圖。模板用的是商品化DNA（KRAS和NRAS）和來自冷凍腫瘤組織的DNA（EGFR）。WT：野生型。

B：散點圖顯示加入DNA內(nèi)部質(zhì)控品ØX174時，三色通道中的熒光信號。

由于已知在KRAS和NRAS突變熱區(qū)中存在多種突變，EGFR 19號外顯子中存在不同長度的缺失或者插入，Drop-off實驗設(shè)計實現(xiàn)了用最少種類的探針達到快速、經(jīng)濟、有效地同時篩查多種具有臨床意義的基因突變。如果需要，通過Drop-off實驗確定某個樣本為突變體后，即可使用序列特異性探針進行檢測，從而確定DNA樣本中存在的確切突變位點。

應(yīng)用亮點：

● Drop-off數(shù)字PCR檢測能夠同時檢測基因組熱點區(qū)域發(fā)生的多種突變

● Drop-off實驗實現(xiàn)了使用至少種類的探針，快速、經(jīng)濟、有效地篩選多種遺傳變異

Naica^TM數(shù)字PCR系統(tǒng)可以實現(xiàn)加入內(nèi)部質(zhì)控品的同時，使用Drop-off檢測方法進行臨床應(yīng)用中通常檢測的7種KRAS突變、4種NRAS突變和發(fā)生在EGFR19外顯子的缺失/插入。

數(shù)字PCR學(xué)堂

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