驗(yàn)證抗體對(duì)于結(jié)果的一致性和重復(fù)性是至關(guān)重要的，即確認(rèn)抗體能特異性識(shí)別感興趣的蛋白，抗體與其他蛋白的交叉反應(yīng)性情況。在您的論文提交給期刊發(fā)表之前，經(jīng)常需要驗(yàn)證抗體的特異性，但并非所有人都花時(shí)間進(jìn)行驗(yàn)證�；蛘吆芏嗳硕颊J(rèn)為他們使用抗體進(jìn)行了免疫共沉淀驗(yàn)證，因而不需要再通過蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行驗(yàn)證。然而，抗體與抗原的親和性高度依賴于實(shí)驗(yàn)條件，因此，驗(yàn)證您的試驗(yàn)方法中的條件適用于抗體與抗原的結(jié)合是十分重要的。
定量western blot尤其適用于確認(rèn)獲得的信號(hào)僅來自感興趣的蛋白。如果沒有進(jìn)行抗體驗(yàn)證（并且驗(yàn)證熒光信號(hào)與蛋白質(zhì)的量呈線性關(guān)系），將無法獲得下游定量分析所需的準(zhǔn)確度和精確度。
為確保實(shí)驗(yàn)質(zhì)量，國際抗體驗(yàn)證工作組提供了五種不同的抗體驗(yàn)證方法，其中四種方法適用于western blot，他們建議至少使用其中兩種方法進(jìn)行抗體驗(yàn)證。
 
遺傳策略
盡管這些方法已經(jīng)被更新了，但在科研領(lǐng)域中的生物化學(xué)家對(duì)他們應(yīng)該都很熟悉。即用CRISPR-Cas9或RNA干擾（RNAi）在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中進(jìn)行敲除或敲低實(shí)驗(yàn)，然后使用特異性抗體測定目標(biāo)蛋白的熒光信號(hào)。處理后的目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)很少甚至沒有，所以觀察到的任何信號(hào)都表明抗體存在交叉反應(yīng)性。
如左圖所示，將具有特定蛋白質(zhì)的細(xì)胞裂解物進(jìn)行western blot，分別使用兩種不同siRNA分子敲低目的蛋白的表達(dá)，如泳道1和泳道2，與泳道C的對(duì)照組相比，我們可以看出siRNA脫靶帶來的影響。