檢測肝癌細胞基因表達的實驗方法！
 
材料與方法
 
⒈材料
 
人肝癌細胞系HepG2由中國醫(yī)科大學(xué)科學(xué)實驗中心保存。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自BioInd公司。細胞轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000和Trizol購自Invitrogen公司。BDNF AS質(zhì)粒、BDNF AS與BDNF基因完全互補序列缺失突變質(zhì)粒以及空載體質(zhì)粒購自上海和元生物公司。無內(nèi)毒素質(zhì)粒中提試劑盒購自天根生化科技公司。GoScript TM Reverse Transcription System反轉(zhuǎn)錄試劑盒和GoTaq ® qPCR Master Mix試劑盒購自Promega公司。BDNF AS和BDNF引物購自O(shè)rigene公司。BDNF兔抗人一抗和GAPDH引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司。β-actin小鼠抗人一抗和羊抗兔IgG、羊抗小鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。BCA蛋白質(zhì)含量檢測試劑盒購自南京凱基生物技術(shù)有限公司。
 
Alexa Fluor ® 594驢抗兔熒光二抗購自Thermo Fisher Scientific公司。Quantikine ®  ELISA Human BDNF Immunoassay試劑盒購自R&D Systems公司。FISH試劑盒以及Cy5標(biāo)記的lncRNA BDNF AS探針和Cy3標(biāo)記的BDNF mRNA探針由Creative Bioarray公司設(shè)計并合成, 其中, BDNF AS探針既能檢測內(nèi)源也能檢測外源轉(zhuǎn)入的lncRNA BDNF AS。
 
⒉實驗方法
 
⑴細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染
 
肝癌細胞HepG2使用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基, 37 °C、5% CO2條件培養(yǎng)。采用細胞轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamin 3000轉(zhuǎn)染, 將BDNF AS質(zhì)粒、BDNF AS與BDNF基因完全互補序列缺失突變質(zhì)粒以及空載體質(zhì)粒分別瞬時轉(zhuǎn)染HepG2細胞, 轉(zhuǎn)染過程按試劑說明書進行, 簡述如下。轉(zhuǎn)染前24 h給細胞傳代, 保證轉(zhuǎn)染時細胞達到90%融合。用Opti-MEM稀釋Lipofectamine 3000, 同時, 用Opti-MEM稀釋質(zhì)粒DNA后加入P3000混勻。
 
將稀釋好的DNA和Lipofectamin 3000混合, 室溫孵育5 min后加入細胞, 繼續(xù)培養(yǎng)48 h用于下述實驗。細胞實驗至少重復(fù)3次。
 
⑵qPCR方法檢測lncRNA BDNF AS和BDNF mRNA水平
 
Trizol提取細胞總RNA, 紫外分光光度計測定RNA濃度和純度, 取5 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。qPCR應(yīng)用Roche LightCycler 480 Real-time PCR擴增儀完成, 按照試劑盒提供的操作說明書進行。BDNFAS引物序列分別為F: 5′-TAC CAC AAG GTA CCA
ACC ATA TAT G-3′, R: 5′-CAT GTG GTT CTG TTT CAA TGC CC-3′, PCR產(chǎn)物長度135 bp。BDNF引物序列分別為F: 5′-CAT CCG AGG ACA AGG TGG CTT G-3′, R: 5′-GCC GAA CTT TCT GGT CCT CATC-3′, PCR產(chǎn)物長度161 bp。反應(yīng)條件為: 95℃預(yù)變性2 min; 95℃擴增15 s, 60℃退火1 min, 共40個循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參, 采用2 –ΔΔCt 方法進行數(shù)據(jù)分析。
 
⑶ Western blot方法檢測BDNF蛋白質(zhì)水平
 
細胞加入RIPA細胞裂解液和蛋白酶抑制劑, 置于冰上裂解。4℃條件下離心, 取上清, 按BCA試劑盒說明測定蛋白質(zhì)濃度。取80 μg總蛋白, 采用12%SDS-PAGE分離, 并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后, 分別用兔抗人BDNF和小鼠抗人β-actin(1)002 4抗-4℃孵育過夜, 然后用山羊抗兔IgG或山羊抗小鼠IgG(1 2育孵溫室)000 2發(fā)LCE ,h׃光成像。采用Image Pro-plus 6.0軟件測定每個蛋白條帶的積分光密度值, 計算同一個樣品BDNF和β-actin積分光密度之間的比值, 作為BDNF的相對表達量。
 
⑷ELISA方法檢測培養(yǎng)上清中BDNF蛋白質(zhì)水平
 
離心收集細胞上清液用于檢測BDNF蛋白質(zhì)水平。ELISA實驗操作按照試劑盒說明進行, 簡述如下。50 μL待測樣品或標(biāo)準(zhǔn)品用100 μL檢測稀釋液稀釋后, 加到孔板中室溫孵育2 h, 加入100 μLBDNF偶聯(lián)抗體室溫孵育1 h, 加入200 μL底物溶液顯色。多功能酶標(biāo)儀校正波長設(shè)定570 nm, 于450 nm波長處讀取吸光度值。
 
⑸免疫熒光染色觀察BDNF蛋白質(zhì)水平
 
PBS漂洗細胞, 用4%多聚甲醛室溫固定, 5% BSA封閉后,向細胞中滴加兔抗人BDNF一抗(1抗驢及)釋稀002׃兔熒光二抗(Alexa Fluor 594), DAPI復(fù)染細胞核, 熒光顯微鏡觀察并采集圖像, 采用Image Pro-plus 6.0軟件測定細胞的平均光密度值。
 
⑹FISH方法檢測lncRNA BDNF AS和BDNF mRNA水平和定位
 
FISH實驗操作按照試劑盒說明進行, 簡述如下。分別用0.2 mol/L HCl和0.3%Triton X-100室溫孵育細胞, 4%多聚甲醛室溫固定細胞后, 向細胞中滴加RNA雜交緩沖液, 55℃預(yù)雜交2 h。將RNA探針(探針用雜交緩沖液1)釋稀002׃于85℃變性5 min, 37℃保持2 min。向細胞中滴加探針, 橡膠膠水封片, 在37℃濕盒中避光雜交過夜。
 
DAPI復(fù)染細胞核, 激光掃描共聚焦顯微鏡(FV1000,Olympus)采集圖像, 采用Image Pro-plus 6.0軟件測定細胞的平均光密度值。
 
⒊統(tǒng)計學(xué)分析
 
實驗采用SPSS 13.0軟件處理數(shù)據(jù)。One-WayANOVA分析用于比較不同處理組細胞之間的差異,組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗。結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示, P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

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