一步法Crystal RT-數(shù)字PCR(Crystal RT-dPCR)直接進(jìn)行RNA絕對(duì)定量檢測(cè)
瀏覽次數(shù):5700 發(fā)布日期:2019-5-22
來源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責(zé)任自負(fù)
一步法反轉(zhuǎn)錄-PCR(RT-PCR)廣泛用于RNA分析,如基因組表達(dá)、病毒檢測(cè),從生命科學(xué)研究到診斷的許多領(lǐng)域,都有所應(yīng)用。一步法Crystal RT-數(shù)字PCR實(shí)現(xiàn)了直接對(duì)RNA樣本進(jìn)行多重靶標(biāo)基因的檢測(cè)(內(nèi)參基因、多重目標(biāo)基因)和病毒RNA的絕對(duì)定量,無需標(biāo)準(zhǔn)曲線,同時(shí)實(shí)現(xiàn)了基因表達(dá)的細(xì)微差異的精確檢測(cè)。
一步法Crystal RT-數(shù)字PCR技術(shù)(Crystal RT-dPCR)實(shí)現(xiàn)了同一個(gè)反應(yīng)中,通過三個(gè)熒光通道進(jìn)行三種不同的mRNA分析,可以顯著且準(zhǔn)確地區(qū)分1.5倍的基因表達(dá)差異(圖1)。
圖1:一步法Crystal RT-數(shù)字PCR(Crystal RT-dPCR)對(duì)人總RNA中mRNAs進(jìn)行絕對(duì)定量
對(duì)人總RNA進(jìn)行1.5倍倍比稀釋,濃度變化范圍0.06ng/µl-3.6ng/µl,通過一步法Crystal RT-數(shù)字PCR對(duì)GUSB、ALB和TSN的三種mRNA進(jìn)行三重絕對(duì)定量檢測(cè)。使用1x qscript XLT One-step RT PCR Toughmix® 和FAM-、HEX和Cy5-標(biāo)記的三種TaqMan
TM 探針。重復(fù)三次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示每個(gè)靶標(biāo)基因均具有良好的線性,準(zhǔn)確性和再現(xiàn)性。GUSB = 588. 8 cp / ng:ALB = 96.5 cp / ng:TSN = 980.6 cp / ng
低表達(dá)水平轉(zhuǎn)錄子的定量檢測(cè)
對(duì)于背景高的總RNA中低豐度轉(zhuǎn)錄子的檢測(cè)極具挑戰(zhàn),使用Crystal數(shù)字PCR技術(shù)在檢測(cè)低比例的轉(zhuǎn)錄子定量檢測(cè)具有出色的線性和重復(fù)性(圖2A)。即使在高濃度總RNA背景的情況下熒光強(qiáng)度一致,反應(yīng)效率不受影響(2μg-圖2B)。
圖2:一步法Crystal RT-數(shù)字PCR絕對(duì)定量檢測(cè)高濃度總RNA中的mRNA
對(duì)人總RNA進(jìn)行2倍倍比稀釋,濃度變化范圍從2 µg 到125 ng,通過一步法Crystal RT-數(shù)字PCR對(duì)ALB的mRNA進(jìn)行絕對(duì)定量。使用1x qscript XLT One-step RT PCR Toughmix®和HEX-標(biāo)記的TaqMan
TM 探針。
線性圖顯示重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性(A),并且在微滴熒光散點(diǎn)圖中未觀察到熒光的變化(B)。 RFU:相對(duì)熒光單位。 *每次反應(yīng)27μL。
病毒RNA的絕對(duì)定量
登革熱1型病毒DEN-1和其他三種相近的血清型可以產(chǎn)生致命風(fēng)險(xiǎn),如登革熱出血熱、登革熱休克綜合征。一步法Crystal RT-數(shù)字PCR,可以實(shí)現(xiàn)2.5個(gè)小時(shí)內(nèi),在無需標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)曲線的情況下,對(duì)登革熱病毒載量進(jìn)行絕對(duì)定量檢測(cè),快速,友好且適用于所有實(shí)驗(yàn)室和工作流程。
圖3:一步法Crystal RT-數(shù)字PCR絕對(duì)定量DEN-1病毒載量
將DEN-1病毒RNA(制造商通過數(shù)字PCR定量的標(biāo)準(zhǔn)品)中摻入300cp人總RNA作為背景,以ABL mRNA作為內(nèi)參。使用1x qscript XLT One-step RT PCR Toughmix®,F(xiàn)AM探針檢測(cè)DEN-1病毒,HEX探針檢測(cè)ABL基因。線性擬合程度達(dá)0.99,重復(fù)性好。
聯(lián)系我們:北京深藍(lán)云生物科技有限公司
地址:北京市北京經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)經(jīng)海四路25號(hào)院2號(hào)樓2單元2層201室
電話:010-57256059
郵箱:info@cycloudbio.com