在上期我們回顧了使用多重來成像磷酸化蛋白的技巧，在這部分中，我們將介紹使用Azurespot分析軟件進行定量。  
背景去除

背景扣除對于有效定量是必不可少的。 例如，AzureSpot有五個自動后臺選項和三個手動選項。

  > 如果背景不均勻，請使用 Rolling Ball。 類似指定半徑的圓盤在泳道輪廓下“滾動”，對信號求平均，從而產(chǎn)生平滑小的變化。 半徑越大，滾動越平滑。

> 如果輪廓的末端與輪廓的其余部分沒有太大差異，請使用Rubber Band。 這種方法就像在泳道輪廓下拉伸橡皮筋一樣。謹慎使用此方法，在泳道邊緣找到最低點，繪制泳道稍微不同，值就會發(fā)生變化。通常，這種計算方法很難做重復分析。
 
  > 如果您已經(jīng)執(zhí)行了條帶檢測，則可以使用Valley to Valley，它使用每個條帶的邊緣來確定和減去背景。 輸入最大斜率非常重要，以避免將重疊條帶之間的邊緣識別為背景。
  > Minimum Profile方法是將最小值將設置為背景
  > LaneEdge Subtraction使用每個泳道邊緣的兩個值中的較低值作為背景。
 
歸一化
  AzureSpot可以通過三種方式執(zhí)行歸一化。 首先，它可以設置標準凝膠中泳道中特定條帶的歸一化。 在多重凝膠中，它可以用看家蛋白或總蛋白質(zhì)歸一化。
  總蛋白歸一化（TPN）變得越來越普遍，因為它具有更高的準確性和對定量蛋白印跡的適應性。 如果您已經(jīng)驗證了您的看家蛋白的表達沒有改變，那么它可能是合適的。 否則，TPN是首選。

 

在轉印后免疫檢測之前用總蛋白質(zhì)染劑（例如AzureRed熒光總蛋白染劑）染膜。 該方法不依賴于抗體，并且考慮了樣品蛋白質(zhì)加載和轉移效率的變化。

  不要忘記使用稀釋系列來確認線性檢測范圍，這可確保信號強度與樣品量成正比

  AzureSpot執(zhí)行歸一化。 紫色線始終是背景，綠色線之上將是信號。 首先選擇一條泳道作為參考泳道（或標準化標準）。 對于每個泳道，計算歸一化因子即泳道中所有條帶的灰度值除以參考泳道中的所有條帶的灰度值。 接下來計算所有通道中的歸一化值，即條帶的原始灰度值除以歸一化因子。

 

(LNF:歸一化因子 TPS:總蛋白染色)

 

  在整個凝膠上加入相同量的蛋白質(zhì)樣品。 蛋白質(zhì)濃度測定可以幫助確定是否需要調(diào)整濃度。

 Examples of signal intensity for different proteins at different concentrations (Ghosh, et al. 2014

 

  在歸一化之前確保您的上樣量處于線性動態(tài)范圍內(nèi)，此范圍因濃度而異

  通過有效的背景扣除和總蛋白歸一化，您將可對磷酸化蛋白進行有效的定量分析。