做western blot印跡膜時(shí)，較大的蛋白質(zhì)眾所周知是難以處理的。 特別是，您可能很難實(shí)現(xiàn)良好的轉(zhuǎn)印效率。 在某些方面，蛋白質(zhì)難以朝著你想要的方向前進(jìn)。

我們將給5點(diǎn)建議，幫助膠上大分子量蛋白的轉(zhuǎn)印。

01

犧牲膠的韌性來提高效率

低濃度的丙烯酰胺凝膠可能難以操作。一旦手指觸摸它就會(huì)撕裂？ 但是，與高濃度的凝膠相比，大蛋白將更有效地從較低濃度的凝膠中移出（分辨率更好）。因此，提高你的靈活性和耐心，嘗試6-7.5％的凝膠。 或者可以嘗試使用梯度凝膠，可以同時(shí)分辨小分子量和大分子量蛋白質(zhì)。

02

去除去垢劑

較大的蛋白質(zhì)可能在凝膠中沉淀，抑制轉(zhuǎn)印。 在SDS-PAGE期間添加的SDS通常會(huì)解決這個(gè)問題，但較大的蛋白質(zhì)可能需要更多的SDS。 您可以在轉(zhuǎn)印緩沖液中添加最多0.1％的SDS以阻止沉淀的產(chǎn)生。因?yàn)镾DS抑制蛋白質(zhì)與膜的結(jié)合，因此請(qǐng)嘗試從低濃度的SDS開始（例如0.0375％），然后逐步提高。

如果確實(shí)在轉(zhuǎn)印緩沖液中添加了SDS，則需要重新優(yōu)化其他轉(zhuǎn)印條件，如轉(zhuǎn)印時(shí)間和電流，以防止蛋白透過膜。

03

降低甲醇濃度

甲醇與SDS具有相反的作用。 雖然甲醇增加蛋白與膜的結(jié)合，但它從蛋白質(zhì)中剝離SDS。 因此，降低轉(zhuǎn)印緩沖液中的甲醇濃度也有助于防止蛋白沉淀。 您可以將濃度降低到10％或更低。 如果您使用的是PVDF膜，則可以完全省去甲醇。 在使用之前，不要忘記用甲醇將膜激活！

甲醇也會(huì)導(dǎo)致凝膠收縮，所以如果減少甲醇，你的凝膠會(huì)膨脹得更多。 這也有助于轉(zhuǎn)移大分子量蛋白。 但您可能需要使用比正常情況稍大的濾紙和膜。

04

慢速轉(zhuǎn)印大分子量蛋白

大分子量蛋白想要獲得良好的轉(zhuǎn)移效率可能需要更多時(shí)間。 快速移動(dòng)那些大分子可能很困難。 嘗試以較低的電壓過夜轉(zhuǎn)印。 只是不要忘記保持轉(zhuǎn)印要在低溫環(huán)境！

05

使用濕轉(zhuǎn)

雖然半干轉(zhuǎn)印可能更適合設(shè)置并且需要較少的緩沖液，但它確實(shí)有其缺點(diǎn)。 半干轉(zhuǎn)印通常比濕轉(zhuǎn)移效率低，并且不能增加轉(zhuǎn)印時(shí)間以適應(yīng)更大的蛋白。 轉(zhuǎn)移大蛋白時(shí)最好堅(jiān)持使用濕轉(zhuǎn)。