剖析|你想要知道的數(shù)字PCR應(yīng)用及前景

 

一． PCR的發(fā)展歷史

 

PCR技術(shù)自問世以來，在遺傳病、病原體、癌基因等分子診斷領(lǐng)域和法醫(yī)鑒定等方面發(fā)揮了巨大作用。第一代 PCR在進行擴增后通過凝膠電泳進行定性分析。

 

隨著生物分子熒光技術(shù)的發(fā)展，1992年實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR, qPCR) 應(yīng)運而生。qPCR是一種在DNA擴增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)熒光強度來測定每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。由于在PCR擴增的指數(shù)時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，所以Ct值也就成為定量的依據(jù)�；�于熒光探針或染料的第二代 PCR 技術(shù)隨后逐漸發(fā)展為檢測核酸目標(biāo)片段的主流分子診斷學(xué)技術(shù)。

 

 

在實時定量 PCR（qPCR） 過程中，熒光信號隨著擴增產(chǎn)物的積累而增強。qPCR 能夠?qū)崟r獲得模板擴增的熒光值，然后根據(jù)DNA 模板在指數(shù)增長時期的 Ct 值與標(biāo)準(zhǔn) DNA 的Ct值比較來計算初始模板的濃度。但是這種方法由于是大體積反應(yīng)系統(tǒng)，非特異性的擴增增加了假陽性結(jié)果和背景信號，因此，最終無法獲得絕對定量的結(jié)果。

 

隨著MEMS工藝的不斷成熟和微流控技術(shù)的不斷發(fā)展，新一代PCR技術(shù)，數(shù)字PCR(digital PCR, dPCR) 也隨之出現(xiàn)。digital PCR是一種新的絕對定量PCR，主要是對PCR反應(yīng)物進行有限稀釋，隨后在不同的反應(yīng)腔室里進行PCR擴增，最后根據(jù)泊松分布原理及陽性微滴的個數(shù)與比例得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度的技術(shù)。

 

圖1. PCR技術(shù)的發(fā)展歷程

 

二． 數(shù)字微流控（dPCR）的原理

 

20 世紀(jì)末，Vogelstein 等提出數(shù)字PCR( digitalPCR，dPCR) 的概念，通過將一個樣本分成幾十到幾萬份，分配到不同的反應(yīng)單元，每個單元包含一個或多個拷貝的目標(biāo)分子( DNA 模板) ，在每個反應(yīng)單元中分別對目標(biāo)分子進行PCR 擴增，擴增結(jié)束后對各個反應(yīng)單元的熒光信號進行統(tǒng)計學(xué)分析。

 

dPCR是一種核酸分子絕對定量技術(shù)。

 

dPCR一般包括兩部分內(nèi)容，即PCR擴增和熒光定量分析。

 

在PCR 擴增階段，與傳統(tǒng)技術(shù)不同，dPCR一般需要將樣品稀釋到單分子水平，并平均分配到幾萬個反應(yīng)腔室里反應(yīng)。這樣子相當(dāng)于變相的對靶基因進行富集。與此同時，由于對原樣品的大幅度的稀釋，使得PCR抑制劑濃度顯著降低，這樣dPCR對初始PCR反應(yīng)物里抑制劑的要求顯著低于qPCR。

 

不同于 qPCR對每個循環(huán)進行實時熒光測定的方法，dPCR 技術(shù)是在擴增結(jié)束后對每個反應(yīng)單元的熒光信號進行采集，最后根據(jù)泊松分布原理及陽性微滴的個數(shù)與比例得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度。

 

圖2. dPCR基本原理

 

三. dPCR與qPCR的對比

 

相對于熒光定量PCR（qPCR）而言，dPCR具備以下優(yōu)勢：

 

1、 靈敏度可達單個核酸分子：檢測限低至0.001%，原因在于dPCR可以實現(xiàn)靶標(biāo)DNA/RNA的富集；

 

圖3. dPCR可以實現(xiàn)痕量核酸的高靈敏檢測

 

2、 無需標(biāo)準(zhǔn)品（標(biāo)準(zhǔn)曲線），即可對靶分子起始量進行絕對定量；

 

3、 特別適合基質(zhì)復(fù)雜樣品的檢測：終點PCR檢測，不依賴Ct值，不依賴擴增效率，能克服PCR抑制劑的影響，適合動血樣、FFPE組織、糞便、尿液、痰液、水樣、土壤、植物等復(fù)雜樣品中DNA的絕對定量；

 

4、 能夠有效區(qū)分濃度差異（變化）微小的樣品：更好的準(zhǔn)確度、精密度和重復(fù)性，可以用于精確測定靶基因的相對表達，基因拷貝數(shù)變異分析等。

 

圖4. qPCR和dPCR的對比

 

四．dPCR的多指標(biāo)檢測的實現(xiàn)

 

如同qPCR一樣，dPCR中實現(xiàn)多指標(biāo)的并行檢測能顯著降低檢測成本，獲取更豐富的檢測信息。

 

不同于qPCR中的多腔室擴增與多熒光通道結(jié)合的并行PCR方式，在dPCR里，一個微反應(yīng)腔室里一般只含一種靶基因。

 

圖5. dPCR的多指標(biāo)并行檢測的實現(xiàn)方式

 

所以dPCR的多指標(biāo)檢測主要通過以下兩種方式實現(xiàn)：

 

1. 多個熒光通道。使用多種熒光染料來標(biāo)記不同的要檢測的靶基因。

 

2. 單波長多強度。使用一種熒光染料，但是擴增結(jié)束時不同的靶基因?qū)��?yīng)的染料的熒光強度不一樣。

 

五．dPCR的分類以及相關(guān)的產(chǎn)品

 

微流控芯片技術(shù)能夠快速并準(zhǔn)確地將樣品流體分成若干個獨立的單元, 從而進行多步平行反應(yīng)，并且具有成本低、體積小和高通量等特點，是理想的數(shù)字PCR平臺。按照其獨立的單元的實現(xiàn)方式來細分，dPCR又分為基于液滴微流控（droplet microfluidics）的微滴數(shù)字PCR（droplet digital PCR, ddPCR）和基于芯片式微流控的微陣列芯片式PCR。

 

5.1微滴數(shù)字PCR（droplet digital PCR, ddPCR）

 

微滴數(shù)字PCR主要是將兩種互不相溶的液體，以其中一種作為連續(xù)相（油），另一種作為分散相（水），在水/油兩相表面張力和剪切共同作用下分散相以微小體積單元的形式存在于連續(xù)中，從而成液滴。這種液滴式的反應(yīng)腔室具有體積小、樣品間無擴散等優(yōu)勢。

 

在ddPCR中，利用微滴發(fā)生器可以一次生成數(shù)萬乃至百萬個納升甚至皮升級別的單個油包水微滴，作為數(shù)字 PCR 的樣品分散載體。這里，液滴中包裹了單拷貝DNA模板和PCR反應(yīng)液，然后將液滴收集在PCR反應(yīng)管中進行擴增。ØPCR反應(yīng)結(jié)束后檢測每個微滴的熒光信號。

 

目前Bio-Rad公司的QX100系統(tǒng)、QX200系統(tǒng)均為采用液滴技術(shù)的數(shù)字PCR系統(tǒng)。

 

圖6. Bio-Rad的droplet digital PCR系統(tǒng)

 

5.2 微陣列芯片式PCR

 

微陣列芯片式PCR主要通過芯片設(shè)計將納升液體封閉在高通量的微池或微量通道中進行后續(xù)的PCR擴增及擴增后結(jié)果的熒光顯微鏡直接判讀。

 

按芯片設(shè)計方式，微陣列芯片式PCR又可以分為陣列微池式芯片、滑片式芯片和集成微泵閥芯片：

 

1. 陣列微池式芯片上刻蝕有微池陣列，反應(yīng)液由進樣孔直接導(dǎo)入個反應(yīng)微池；

 

2. 滑片式芯片是設(shè)計帶有微流體通道和反應(yīng)單元的玻璃芯片，上下兩篇玻璃芯片間用油相密封，通過滑動芯片將樣品溶液從液體通道引入反應(yīng)單元，同時生成成百上千個微反應(yīng)滴陣列；

 

3. 集成微泵閥式芯片是通過多層軟刻蝕技術(shù)在聚二甲基硅氧烷（PDMS）芯片上加工交織的液體和氣體通道結(jié)構(gòu)，通過精確地控制微泵閥的開啟和關(guān)閉，快速并準(zhǔn)確地將流體分成若干個陣列的獨立單元。

 

2010年，Life Technologies也推出了基于陣列微池式芯片的數(shù)字PCR產(chǎn)品線–OpenArray系統(tǒng)。它提供的TaqMan OpenArray 數(shù)字PCR試劑盒可在OpenArray平板上運行。平板可在現(xiàn)有的OpenArray 實時定量PCR系統(tǒng)以及新上市的QuantStudio™ 12K Flex儀器上運行。OpenArray 實時定量PCR系統(tǒng)能夠同時運行3塊OpenArray平板。

 

圖7. TaqMan® OpenArray® Digital PCR系統(tǒng)

 

Fluidigm公司于2006年底推出了基于集成流體通路（IFC）芯片的Bio-Mark™ 高通量基因剖析系統(tǒng)。

 

其創(chuàng)新在于集成液體通路技術(shù)：應(yīng)用集成電路制造工藝（光刻）在硅片或石英玻璃上刻上許多微管和微腔體，經(jīng)過不同的控制閥門控制溶液在其中的活動來完成生物樣品的分液、混合、PCR擴增。

 

圖8. Bio -Mark™ IFC芯片

 

六．dPCR的應(yīng)用前景

 

6.1 痕量核酸檢測

 

圖 9. 痕量核酸檢測的具體分類

 

dPCR尤其適合：對靈敏度要求非常高的核酸痕量分析研究；基質(zhì)復(fù)雜樣品中的核酸準(zhǔn)確定量（如組織、體液、排泄物等樣品）。

 

圖10. 痕量核酸檢測相關(guān)方法比較

 

6.1.1 癌癥標(biāo)志物稀有突變檢測

 

在一份給定的樣本中，相比于野生型DNA，癌癥相關(guān)的突變序列比例較低，經(jīng)常無法檢測。而憑借其超高靈敏度，dPCR系統(tǒng)可以很容易地定量分析低至0.001%-0.0001%的突變頻率。之前用任何方法都無法實現(xiàn)準(zhǔn)確穩(wěn)定檢測的樣本，現(xiàn)在可以使用dPCR輕松進行定量分析。

 

是否能夠開發(fā)出有效的靶向治療藥物，與突變基因的檢測密切相關(guān)。其中（1）攜帶藥物作用突變位點的癌細胞百分比；（2）突變的特定等位基因是否可以被準(zhǔn)確檢測到，這兩點都直接影響到靶向治療是否有效。很顯然，在腫瘤均質(zhì)細胞內(nèi)檢測單一突變相對簡單，但是如果在異質(zhì)組織內(nèi)，在僅存有少量突變存在的情況下，如何準(zhǔn)確檢測出突變/稀有變異，或者針對于同一種癌癥中多種亞克隆的準(zhǔn)確鑒定，對個性化醫(yī)療的發(fā)展是一個巨大的挑戰(zhàn)。

 

案列1. 實現(xiàn)肺癌相關(guān)的表皮生長因子受體（EGFR）中T790M突變的檢測，可以更好地評估抗酪氨酸激酶抑制劑的治療。然而，由于其他技術(shù)檢測靈敏度有限，無法在高背景EGFR野生型中可靠地檢測到T790M突變。研究人員使用dPCR技術(shù)開發(fā)出精確度很高的檢測方法，以準(zhǔn)確定量T790M的濃度[1]。

 

圖11. ddPCR可以用EGFR突變的肺癌患者的血漿中游離DNA（cfDNA）為樣本，檢測與EGFR敏感性和藥物抗性相關(guān)的突變

 

6.1.2 致病微生物檢測

 

精確的病毒載量分析對于闡釋疾病病程，后續(xù)治療及療效評估是至關(guān)重要的。病毒載量的波動，即使只下降了非常低的水平，意義卻是顯著的。在對病原體的研究中，能否實現(xiàn)準(zhǔn)確而可靠的病毒DNA或RNA定量分析，關(guān)系到實驗的成敗。

 

案列2. 研究人員比較了 qPCR 和 dPCR 方法檢測臨床樣本中殘留的人類免疫缺陷病毒（HIV），其中包括功能性治愈的HIV感染嬰兒。研究人員發(fā)現(xiàn)，在檢測百萬個細胞內(nèi)的 HIV DNA拷貝數(shù)時，相比于 qPCR，dPCR 的靈敏度提升了5倍；在檢測病毒長末端重復(fù)序列時，dPCR比qPCR靈敏提升了20倍[2]。

案列3. 研究人員探索HBV血清學(xué)和ddPCR檢測結(jié)果與肝細胞癌（HCC）臨床分期和病癥之間的關(guān)系中，ddPCR成功的克服了real-time PCR（qPCR）在檢測FFPE處理的肝癌患者組織樣品中HBV DNA時，遇到的準(zhǔn)確度、靈敏度和重復(fù)性不足的缺點。進而得出以下結(jié)論： 1、ddPCR的靈敏度和準(zhǔn)確度比real-time PCR更高——131個待測樣品中HBV DNA濃度范圍為1.1~175.5 copies/ul； 2、即使是在24個血清學(xué)檢測呈陰性的樣本中也檢測到了痕量的HBV DNA； 3、樣品中HBV DNA的含量與肝細胞癌（HCC）組織的臨床分期一致； 4、ddPCR技術(shù)可以用于肝癌的早期無創(chuàng)診斷，病程監(jiān)控，肝移植、化療或免疫抑制的療效評估[3]。

 

6.2 與新一代測序（NGS）的無縫對接

 

相對于NGS， dPCR可以富集待測序樣品中的靶基因; dPCR還可以驗證 / 精確定量測序結(jié)果。

 

圖12. ddPCR和NGS的優(yōu)勢互補

 

案列4. 由于人間充質(zhì)干細胞（MSC）在人體內(nèi)的含量極低，所以目前應(yīng)用于臨床治療的MSCs都來源于體外培養(yǎng)。研究人員分別對體外培養(yǎng)p1，p8和p13階段（passage）的來源于人骨髓MSC采用全基因組測序(WGS)。WGS結(jié)果顯示在p1和p8階段的培養(yǎng)細胞中沒有拷貝數(shù)變異（CNV）和非常低頻的單核苷酸突變(SNV)，但是p13階段的SNCs數(shù)目顯著增加，達到677個。采用ddPCR對WGS發(fā)現(xiàn)的8個非同義突變進行了確認，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在未經(jīng)培養(yǎng)的單核細胞內(nèi)就含有極低頻對應(yīng)的突變(0.01%)，在p1和p8階段培養(yǎng)的MSC內(nèi)其突變比例依然處于極低比例狀態(tài)(0.1-1%)，但是在p13培養(yǎng)的階段對應(yīng)突變的比例顯著地上升到(17-36%)[4]。

 

6.3 基因表達分析

 

實時熒光定量PCR 常用于檢測基因表達差異，但該方法一般只能檢測出兩倍或者更大的差異。而一些研究則需要檢測低于兩倍的表達變化。dPCR 的檢測精度可達±10%甚至更高，能夠分辨更小的差異。

 

dPCR尤其適合：基因相對表達變化差異較�。�<2倍）的研究；低豐度基因或單細胞的表達分析，以及RNA編輯、等位基因差異表達等研究。

 

圖13. 基因表達分析相關(guān)方法比較

 

6.4 拷貝數(shù)變異分析

 

圖14. 拷貝數(shù)變異

 

拷貝數(shù)變異 (CNV) 分析的目的是確認目的序列的拷貝數(shù)是否偏離野生型序列，以及偏差多少�？截悢�(shù)變異與疾病（癌癥）、代謝途徑、生物種進化等關(guān)系密切。臨床上，CNV可為具體治療方案的制定與修正提供參考；農(nóng)業(yè)及畜牧業(yè)，CNV可作為遺傳育種的遺傳標(biāo)記。

 

傳統(tǒng)實時熒光定量PCR平臺提供了足夠的分辨率，可以鑒別低拷貝數(shù) (如0至5的拷貝數(shù))；但更高的拷貝數(shù)需要更精確的測量，以確定確切的拷貝數(shù)。dPCR尤其適用于更高拷貝數(shù)分析，檢測精度超過±10%。

 

參考文獻：

1. Oxnard G R, Paweletz C P, Kuang Y, et al. Noninvasive detection of response and resistance in EGFR-mutant lung cancer using quantitative next-generation genotyping of cell-free plasma DNA[J]. Clinical cancer research, 2014, 20(6): 1698-1705.

2. Persaud D, Gay H, Ziemniak C, et al. Absence of detectable HIV-1 viremia after treatment cessation in an infant[J]. New England Journal of Medicine, 2013, 369(19): 1828-1835.

3. Huang J T, Liu Y J, Wang J, et al. Next generation digital PCR measurement of hepatitis B virus copy number in formalin-fixed paraffin-embedded hepatocellular carcinoma tissue[J]. Clinical chemistry, 2015, 61(1): 290-296.

4. Cai J, Miao X, Li Y, et al. Whole-genome sequencing identifies genetic variances in culture-expanded human mesenchymal stem cells[J]. Stem cell reports, 2014, 3(2): 227-233.