簡(jiǎn)介
自動(dòng)細(xì)胞成像是一種分析化合物對(duì)包括細(xì)胞形態(tài)，活力和標(biāo)志物表達(dá)在內(nèi)的細(xì)胞表型的影響的有效方法。這里，我們將展示ImageXpress® Pico自動(dòng)細(xì)胞成像系統(tǒng)和CellReporterXpress 自動(dòng)成像分析軟件如何應(yīng)用于化合物影響的表型分析。成像和分析方法可提供工具來(lái)鑒定細(xì)胞活力，細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞黏附和伸展，細(xì)胞骨架完整性和線粒體膜電位等多種參數(shù)。

圖 1：多參數(shù)分析細(xì)胞活力和形態(tài)學(xué)的圖像和分析圖例。用多種藥物處理 HeLa 細(xì)胞 72 小時(shí)然后，使用核染料 (Hoechst 33342) ，Actin 細(xì)胞骨架染料 ( AlexaFluor 488 (AF488) 標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽 ) 還有線粒體染料 (MitoTracker Orange CMTMRos) 染色。代表性的圖像和分析圖例展示了對(duì)照細(xì)胞和 0.1 μM staurosporine 處理后的細(xì)胞的對(duì)比。細(xì)胞使用 ImageXpress Pico 系統(tǒng)的 DAPI, FITC 和 TRITC 通和 10x PlanFluor 物鏡拍攝。圖像 ( 上 ) 標(biāo)記了細(xì)胞核 ( 藍(lán)色 )，actin 細(xì)胞骨架 ( 綠色 )，還有線粒體 ( 桔色 )。圖像使用 CellReporterXpress 軟件中為了定量鬼筆環(huán)肽陽(yáng)性細(xì)胞 ( 中 ) 和 MitoTracker Orange 陽(yáng)性細(xì)胞 ( 下 ) 而優(yōu)化的 Cell Scoring 分析模塊進(jìn)行分析。分析結(jié)果圖例如圖所示 ( 淺綠= actin-陽(yáng)性的核，深綠 = actin細(xì)胞骨架，藍(lán)色 = 線粒體-陽(yáng)性核，紅色 = 線粒體-陰性核，桔色 = 完整線粒體。

細(xì)胞可實(shí)時(shí)分別使用 DAPI，F(xiàn)ITC 還有TRITC 通道對(duì) Hoechst, Calcein AM 還有 MitoTracker Orange 染色進(jìn)行成像。用 10x 物鏡來(lái)拍攝每孔中一個(gè)視野的圖像為單獨(dú)一張圖像。曝光時(shí)間設(shè)為DAPI 通道 20 ms，F(xiàn)ITC 通道 10 ms，TRITC 通道 200 ms。細(xì)胞也可以固定后以后成像或進(jìn)一步染色額外細(xì)胞標(biāo)志物。注意：Calcein AM 用來(lái)評(píng)估活細(xì)胞且固定以后檢測(cè)不到 ( 數(shù)據(jù)未展示 )。MitoTracker Orange 和 Hoechst 33342染色固定后是穩(wěn)定的。為鑒定 actin 細(xì)胞骨架完整性，進(jìn)而將細(xì)胞固定。Mitotracker Orange 和 Hoechst33342 染色后，使用 4% 甲醛溶液固定細(xì)胞然后用 PBS 洗兩遍。而后用DPBS + 0.01% saponin + 1% FBS 對(duì)細(xì)胞膜進(jìn)行穿孔處理 10 分鐘。AlexaFluor® 488(AF488) 連接的鬼筆環(huán)肽染料用來(lái)評(píng)估細(xì)胞骨架完整性。鬼筆環(huán)肽用穿孔緩沖液 (1:50) 稀釋并與細(xì)胞一起在 37 度孵育 2 小時(shí)。細(xì)胞用 PBS 洗滌然后使用 CellReporterXpress 軟件中為定量 AF488 染色的細(xì)胞骨架優(yōu)化的 Cell Scoring 分析模塊進(jìn)行成像分析。使用 ImageXpress Pico 系統(tǒng)成像活細(xì)胞或固定細(xì)胞，并用 CellReporterXpress軟件進(jìn)行分析。細(xì)胞圖像使用兩個(gè) CellScoring 程序進(jìn)行分析：一個(gè)以 FITC 作為標(biāo)記來(lái)定量 Calcein AM 或鬼筆環(huán)肽陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，第二個(gè)程序以 TRITC 為標(biāo)記分析線粒體染色陽(yáng)性細(xì)胞。兩套程序都以核染色進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和核特征鑒定。

使用自動(dòng)成像分析定量分析表型影響

一個(gè)典型的自動(dòng)化細(xì)胞實(shí)驗(yàn)流程包括在微孔板中鋪細(xì)胞，化合物處理細(xì)胞，和自動(dòng)化成像。對(duì)于多色，多參數(shù)實(shí)驗(yàn)，Calcein AM 可用于鑒定活細(xì)胞數(shù)或完好的細(xì)胞數(shù)，描述細(xì)胞伸展和鑒定細(xì)胞形態(tài)學(xué)。核染料用于細(xì)胞計(jì)數(shù)，確定增殖和測(cè)量核亮度和形狀。