簡(jiǎn)介
細(xì)胞凋亡是一種發(fā)生在多細(xì)胞生物體內(nèi)的程序性細(xì)胞死亡過(guò)程！生化反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)和特征變化及細(xì)胞死亡。形態(tài)變化包括細(xì)胞收縮、核分裂、染色質(zhì)凝縮、染色 DNA 分裂及 mRNA 衰減。細(xì)胞凋亡是一種高度調(diào)控的過(guò)程，通過(guò)內(nèi)在途經(jīng)對(duì)各種壓力源做出響應(yīng)，包括饑餓、感染、缺氧和氧化應(yīng)激反應(yīng)等。線粒體損傷在細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。在外部通路中，外部信號(hào)介導(dǎo)了細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生，包括腫瘤壞死因子受體家族介導(dǎo)信號(hào)。以上兩種途徑以及細(xì)胞死亡進(jìn)行過(guò)程都通過(guò)激活 caspase 激酶來(lái)實(shí)現(xiàn)。細(xì)胞凋亡調(diào)控過(guò)程的破壞與包括癌癥在內(nèi)的許多疾病相關(guān)。在這篇應(yīng)用中，我們介紹一種利用自動(dòng)細(xì)胞成像系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)的方法。

實(shí)驗(yàn)方法
將人宮頸癌細(xì)胞系 HeLa, 培養(yǎng)在 Greiner 公司黑邊底透的 96 孔多孔板中，每孔 5,000個(gè)細(xì)胞，37°C, 5% CO2 條件下過(guò)夜培養(yǎng)。第二天，分別用不同濃度的抗腫瘤化合物十字孢堿 (Staurosporine)、絲裂霉素 CMitomycin C) 和喜樹(shù)堿 (Camptothecin)處理這些細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡�；�合物的最高濃度分別為：10 μM 十字孢堿；200 μM 絲裂霉素 C；100 μM 喜樹(shù)堿。加藥處理 18 小時(shí)后，使用試劑盒 EarlyTox™ Caspase-3/

NucView 488 dye 和 Ethidium HomodimerIII 染料以終濃度 5μM 和 3μM 分別對(duì)細(xì)胞染色 30 分鐘, 之后用 Hoechst 33342以終濃度 6 μM 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，同時(shí)將細(xì)胞放回 37°C, 5% CO2 培養(yǎng)箱中靜置 15
分鐘。

EarlyTox Caspase-3/7 NucView488 試劑盒

Caspase-3、caspase-7 是在細(xì)胞程序性死亡過(guò)程中被激活的蛋白酶。EarlyTox試劑盒中的 Caspase-3/7 NucView 488底物用來(lái)檢測(cè)完整細(xì)胞中 caspase-3/7 活性。底物由一種與 caspase-3/7 DEVD 識(shí)
序列結(jié)合的熒光 DNA 染料組成。最初沒(méi)有熒光，底物透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中。在凋亡細(xì)胞中 caspase-3/7 將底物裂解，釋放出的高親和 DNA 染料與細(xì)胞核中的 DNA 結(jié)合，在 500 nm 激發(fā)光照射下在 530 nm 處發(fā)出明亮的綠色熒光，可以用來(lái)評(píng)價(jià) caspase 激酶的激活水平。Hoechst 33342 核染料用來(lái)確定細(xì)胞總個(gè)數(shù)，Ethidium Homodimer 用來(lái)確定死細(xì)胞 ( 即外膜受損的細(xì)胞 ) 的個(gè)數(shù)。

使用自動(dòng)細(xì)胞成像系統(tǒng)評(píng)價(jià)細(xì)胞凋亡

染色之后，使用 ImageXpress® Pico 自動(dòng)細(xì)胞成像系統(tǒng)，在 10x 物鏡條件下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行成像。每個(gè)成像位置分別采集 DAPI,FITC 和 TexasRed 三個(gè)熒光通道，曝光時(shí)間分別為 20, 500, 和 50 ms。圖1 展示了對(duì)照細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞結(jié)果，其中實(shí)驗(yàn)組的化合物濃度分別為 0.3 μM 十字孢堿、10 μM 絲裂霉素 C。Hoechst 染色為藍(lán)色，凋亡細(xì)胞核為綠色，死細(xì)胞核為紅色。使用 CellReporterXpress 軟件中的凋亡分析流程采集樣品圖像并進(jìn)行分析，得到凋亡細(xì)胞數(shù)量和百分含量。同時(shí)，通過(guò)分析 Ethidium Homodimer 染色結(jié)果得到死細(xì)胞數(shù)量，通過(guò)分析 Hoechst 染色結(jié)果得到細(xì)胞總數(shù)的相關(guān)參數(shù)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果生成細(xì)胞凋亡、死亡的濃度效應(yīng)曲線及相應(yīng)的半最大效應(yīng)濃度 (EC50) 值見(jiàn)圖2。值得注意的是激酶抑制劑十字孢堿 ( 一種已知的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物 ) 的 EC50 值比通過(guò)不同的機(jī)制介導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡的絲裂霉素 C低 100 倍左右。

結(jié)論
EarlyTox 試劑盒是一種有效的工具，可用于疾病生物學(xué)研究、抗腫瘤藥物評(píng)價(jià)及細(xì)胞健康狀況監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域。本篇應(yīng)用介紹了一種利用 ImageXpressPico 全自動(dòng)成像系統(tǒng)和 CellReporterXpress 軟件對(duì) Early-Tox 試劑盒染色的樣品進(jìn)行凋亡細(xì)胞量化和評(píng)價(jià)的方法和流程。

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