簡(jiǎn)介
線粒體功能作為細(xì)胞健康度評(píng)價(jià)的關(guān)鍵指標(biāo)，可以通過(guò)檢測(cè)其膜電位變化情況獲得相應(yīng)數(shù)據(jù)。線粒體膜電位去極化作為低氧損傷或氧化應(yīng)激反應(yīng)的早期重要的一種信號(hào)，陽(yáng)離子熒光染料是用于線粒體膜電位評(píng)估的有效工具。我們利用兩種已知的氧化磷酸化抑制劑作為化合物進(jìn)行短時(shí)間 ( 60分鐘 ) 的處理�？姑顾谹 (Antimycin A) 和氰氯苯腙 (CCCP)�；�合物處理后利用 MitoTracker Orange和細(xì)胞核染料分子進(jìn)行染色，此實(shí)驗(yàn)可直接檢測(cè)化合物對(duì)線粒體膜電位的影響。

方法
U2OS 細(xì)胞 (ATCC) 以 6,500 個(gè)每孔的密度預(yù)鋪于黑色底透 384 孔板中 (Greiner,black clear-bottom plates)，隨后第二天利用不同濃度的 Antimycin A 和 CCCP(Sigma) 處理 60 分鐘，每個(gè)處理進(jìn)行三個(gè)重復(fù)，化合物 Antimycin A 起始濃度為100 μM 和化合物 CCCP 起始濃度為 50μM，稀釋比例為 1:3，經(jīng)過(guò) 30 分鐘化合物處理后，使用 MitoTracker Orange 和Hoechst 33342 染料 (Thermo Fisher,Carlsbad, CA) 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，反應(yīng)體

圖一：利用自動(dòng)成像系統(tǒng)評(píng)價(jià)線粒體完整性和膜電位變化。ImageXpress Pico 自動(dòng)細(xì)胞成像系統(tǒng)的20X 物鏡分別對(duì) U2OS 質(zhì)控組細(xì)胞和 CCCP 處理后的U2OS 細(xì)胞成像后，利用 CellReporterXpress 軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析。左側(cè)：成像質(zhì)控組細(xì)胞和 1 μM 的 CCCP 處理后的細(xì)胞，MitoTracker Orange 染料 ( 桔色 )和 Hoechst 核染料 ( 藍(lán)色 ) 分子進(jìn)行的染色處理；右側(cè)：成像分析綠色遮蔽為細(xì)胞核染色后結(jié)，白色遮蔽顆粒為線粒體。 細(xì)胞經(jīng)過(guò)氧化磷酸化抑制劑CCCP 處理后膜電位丟失

系于 PBS 中且最終各自的使用濃度分別是0.1 μM 和 6 μM。細(xì)胞染色過(guò)程于 37 ℃，5% 的 CO2 體系中 30 分鐘，對(duì)活細(xì)胞可直接成像分析或者使用 4% 多聚甲醛固定后在進(jìn)行相應(yīng)觀察。在室溫條件下使用 4%多聚甲醛經(jīng)過(guò) 30 分鐘左右時(shí)間對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定，利用 PBS 緩沖液清洗 2 次，細(xì)胞直接在 ImageXpress Pico 自動(dòng)細(xì)胞成像系統(tǒng)上使用 20x 物鏡進(jìn)行觀察，圖像獲取采用每孔單點(diǎn)方式，利用其 DAPI 和TRITC 熒光通道且曝光時(shí)間分別為 20 ms和 300 ms。

客觀多參數(shù)分析線粒體完整性和膜電位的變化

如下圖一所示，質(zhì)控組細(xì)胞和氧化磷酸化抑制劑 CCCP 處理后的細(xì)胞，可以觀察到期線粒體完整性 ( 桔色 ) 有著顯著的差異，我們利用 CellReporterXpress 軟件預(yù)置的線粒體分析模板來(lái)評(píng)價(jià)其線粒體損傷。細(xì)胞核染色后確定單個(gè)細(xì)胞，分析發(fā)現(xiàn)每個(gè)細(xì)胞內(nèi)顆粒 ( 線粒體 )，可以采用多個(gè)參數(shù)進(jìn)行結(jié)果分析，例如顆�？倲�(shù)、顆粒面積、每個(gè)細(xì)胞內(nèi)的顆粒數(shù)目、平均熒光強(qiáng)度和顆粒的整體熒光信號(hào)強(qiáng)度。結(jié)果以濃度效應(yīng)學(xué)曲線展示出其 EC50 值，如圖二和表一所示。

結(jié)論
線粒體功能紊亂與各種疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，包括神經(jīng)退行性疾病和心血管疾病，以及一些藥物的毒性作用和各種環(huán)境中化合物影響。這次實(shí)驗(yàn)展示出 ImageXpress Pico自動(dòng)細(xì)胞成像系統(tǒng)和CellReporterXpress軟件可在基于細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用方面，有效對(duì)線粒體膜完整性和電位的變化進(jìn)行綜合
有效的評(píng)定。