使用自動細胞成像系統(tǒng)進行細胞毒性評價和細胞活/死測定
簡介
細胞活 / 死測定被廣泛應用于各種研究領域，包括各種化合物的細胞毒性作用、實驗處理或基因表達變化的研究。自動細胞成像和分析系統(tǒng)提供了一種評價細胞活性和細胞死亡的最佳方法。在本篇應用文獻中，我們介紹了使用 ImageXpress®Pico 自動細胞成像系統(tǒng)以及 CellReporterXpress 自動圖像采集和分析軟件對 EarlyToxTM Live/Dead 檢測試劑處理的細胞進行成像。EarlyTox Live/Dead 檢測試劑盒包含了針對哺乳動物活細胞和死細胞的標記物�；罴毎杀辉诩毎|中能夠發(fā)出強烈綠色熒光的Calcein AM 染色。不發(fā)熒光的 Calcein AM 可穿透完整細胞膜且其乙酰羥甲基酯 (AM) 基團可被細胞內的脂酶裂解，得到可發(fā)出熒光的鈣黃綠素分子。死細胞標記物乙啶二聚體-III(EthD-III) 對完整細胞質膜而言既無熒光也無穿透能力。當與死亡細胞相關的細胞膜完整性受到損傷時，EthD-III 進入細胞并與細胞核結合，在細胞中產生明亮的紅色熒光。影響細胞膜完整性的細胞毒性事件可以使用這種方法準確的評估。該檢測試劑盒可對測試化合物的全濃度響應特性進行表征。這種免洗、均相實驗可減少因為洗滌步驟導致的死細胞被沖洗掉的情況。使用 ImageXpress Pico 系統(tǒng)和 CellReporterXpress軟件能準確檢測到來自鈣黃綠素和 EthD-III 的熒光信號并獲得高質量的圖像及分析結果。
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材料 EarlyTox Live/Dead Assay Kit |
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方法
HeLa 細胞以 5,000 細胞 / 孔接種于黑色 384孔底透微孔板中，37°C, 5% CO2 孵育箱內生長過夜。用十字孢堿 (staurosporine )( 通用蛋白激酶抑制劑和潛在的抗癌治療藥物 ) 或絲裂霉素 C ( 強效DNA交聯(lián)劑與化療藥物 ) 處理細胞 24 小時，做 4 個平行，按1:3 梯度稀釋，起始最高濃度為 10 μM 十字孢堿和 300 μM 絲裂霉素 C�；衔锾幚硗瓿珊�，用 Live/Dead 檢測試劑結合 Hoechst33342 核染料 (Thermo Fisher)對細胞進行染色。每孔移去一半體積液體并替換成 2x Calcein AM 和EthD-III 染色液。染色液濃度為 2 μM Calcein AM 和3 μM EthD-III。在添加 Hoechst ( 6 μM 終濃度 ) 前，孔板在 37°C, 5% CO2 下孵育30 分鐘。細胞再次以 37°C, 5% CO2 孵育15 分鐘。最后一次孵育結束后立即將孔板在 ImageXpress Pico 系統(tǒng)上用 10xPlan Fluor 物鏡進行成像，熒光通道分別為針對 Calcein AM 的 FITC 通道、針對 EthD-III的 Texas Red 通道和針對 Hoechst 染料的 DAPI 通道。在此放大倍數(shù)下，一張單獨的圖像一個視野下可以采集多達4000-4500 個細胞，足以獲得統(tǒng)計學相關結果。
使用細胞分類模塊進行圖像分析
利用 CellReporterXpress 軟件中的細胞分類分析模塊對圖像進行分析。此模塊可識別和區(qū)分活細胞或死細胞。Hoechst染色用于識別總細胞，而 Calcein AM 或EthD-III 作為特異性染色用于將細胞分類為陽性或陰性。圖1展示了用十字孢堿處理和未處理的陽性細胞和陰性對照以及相關分析所識別的陽性和陰性細胞。分別進行分析，以確定活細胞或死亡細胞的數(shù)量和百分比。從劑量-應答曲線計算EC50毒性對活細胞和死細胞成像，并基于 CalceinAM (綠色熒光) 或 EthD-III (紅色熒光) 的細胞陽性染色進行細胞分類定量分析 ( 圖1 )。用十字孢堿和絲裂霉素 C 處理 HeLa細胞均展示出濃度依賴性的死細胞百分比的增加和活細胞百分比的下降。圖2所呈現(xiàn)的劑量應答曲線，活細胞百分比對化合物濃度，其十字孢堿的 EC50 值為 0.569μM，而絲裂霉素 C 是 223 μM。死細胞百分比曲線得到的十字孢堿 EC50 值為 0.492μM 而絲裂霉素 C 為 6.305 μM。
總結
EarlyTox Live/Dead 檢測試劑盒結合ImageXpress Pico 系統(tǒng)和 CellReporterXpress軟件，能夠通過簡單高效的工作流程實現(xiàn)對活細胞和死細胞的精確測定。自動成像和定量分析使得我們能夠測試毒性化合物并非常適合于大量生物學檢測中對細胞活性的評價。
