簡介
當需要持續(xù)獲得高質(zhì)量、高精確的數(shù)據(jù)時，那么迫切需要一臺全自動基于細胞檢測實驗的多參數(shù)分析系統(tǒng)。一臺緊湊的，全自動微孔板圖像分析系統(tǒng)可用于多參數(shù)實驗，如利用誘導(dǎo)多功能干細胞 (iPSC) 分化為心肌細胞，神經(jīng)細胞和肝細胞研究中。多重參數(shù)包括細胞活力、細胞凋亡、線粒體膜電位和自噬等對于定義活細胞或固定細胞的毒性機制研究有著重要意義。同樣，我們展現(xiàn)出一些利用無標記細胞分析方式來評價細胞毒性和細胞增殖情況的實例。展示利用新型自動細胞成像分析系統(tǒng)進行生物學(xué)研究和幾種實驗?zāi)Ｐ徒�立，這些都能夠?qū)�學(xué)術(shù)及生物制藥領(lǐng)域的研究具有巨大的促進。

儀器
基于細胞學(xué)實驗的研究可利用 ImageXpress®Pico 自動細胞成像系統(tǒng)結(jié)合 CellReporter-XpressTM 自動圖像分析軟件。此系統(tǒng)在 4 色熒光通道成像的基礎(chǔ)上還可加入透射光成像和彩色成像功能，多種放大倍數(shù)物鏡可選，環(huán)境控制系統(tǒng) (EC)，注射器系統(tǒng)等，可以進行時間序列形式的細胞增殖、分化、化合物毒性以及各種基于細胞學(xué)的實驗。分析軟件采用新的邏輯運算方法對目標對象識別，簡化了分析流程，并可以提供多參數(shù)檢測結(jié)果。

方法
細胞培養(yǎng)：人類的 iPSC 分化的神經(jīng)細胞，心肌細胞或肝細胞購自于 Cellular Dynamics International,Fujifilm Co (CDI)，細胞預(yù)先以 10,000 每孔的密度鋪于黑色底透的 384 孔板內(nèi) (Greiner)，培養(yǎng)條件采用 CDI 推薦方法，Hela 細胞或 PC12 細胞 (ATCC) 培養(yǎng)條件采用廠家推薦方法，化合物處理于鋪板 24 小時后，繼續(xù)在此條件下培養(yǎng) 3 天，如圖中所示。細胞染色：評價表型改變，活細胞染色過程使用三種混合染料，活力染色使用 Calcein AM(1 μM)，線粒體膜電位染料使用 MitoTracker Orange (0.2 μM)，細胞核染料采用 Hoechst (2μM)，所有染料分子均來自于 Life Technologies，為了觀察肌動蛋白細胞骨架，細胞采用 4%多聚甲醛 (Sigma) 固定后使用連接有 AlexaFluor® 488 (AF488) 的鬼筆環(huán)肽進行染色，神經(jīng)細胞染色采用連接有 anti-TuJ-1 抗體進行染色。

評價細胞的形態(tài)和活力
成像和分析方法作為有效的工具可提供多種參數(shù)信息，包括細胞活力，細胞不同時期的特征，細胞粘附性和分布狀況，細胞骨架完整性( 形態(tài)學(xué) ) 和線粒體電勢變化等。

結(jié)果
特異性化合物對神經(jīng)細胞軸突生長影響
神經(jīng)細胞軸突生長表型變化 (iCell Gaba Neurons，CDI) 通過多重檢測手段來定量分析其神級細胞復(fù)雜程度，我們進行多次檢測并且測試了幾種已知的神級毒性化合物作用效果。神級細胞軸突生長發(fā)育特征通過其生長程度進行評價 ( 總的長度或者每個細胞的平均長度 )，神經(jīng)軸突數(shù)目 ( 軸突的總數(shù) )，分支的延伸程度 ( 總的分支數(shù)目和每個細胞的平均分支數(shù)目 )。

評價化合物對心機細胞毒性的作用
評價心肌細胞毒性影響，使用各種不同的心肌細胞毒性化合物處理 24 小時，然后活細胞通過 Hoechst 核染料分子標記后，MitoTracker Orange 染料標記和 AF-488 連接的鬼筆環(huán)肽染料來檢測細胞骨架的完整性。利用 ImageXpress Pico 細胞成像系統(tǒng)獲取圖像，分析過程采用Cell Scoring 邏輯算法檢測總的熒光面積和平均的心肌細胞熒光面積，以及具有完整細胞骨架的細胞所占的百分比。

肝細胞表型變化
iPSC 誘導(dǎo)人肝細胞是非常有價值的細胞模型，可以表現(xiàn)出于原代肝細胞同樣的表型和功能，降低了變量因素和其它原代細胞限制條件后，自動成像系統(tǒng)能夠幫助獲取并分析化合物對肝細胞毒性影響結(jié)果

線粒體膜電位變化和自噬實驗
自噬功能紊亂和線粒體完整性與各種疾病的發(fā)病機制有關(guān)，包括神經(jīng)退行性疾病和心血管疾病，因此，通過這一個過程開發(fā)新型制劑已經(jīng)成為藥物治療最有前景的新方法。PC12 成神經(jīng)細胞瘤細胞系被作用于這些實驗的模型細胞。。

利用透射光進行細胞計數(shù)和凋亡檢測
分析軟件能夠無需借助于任何染料分子而進行細胞分割和計數(shù)，這個應(yīng)用尤其對觀察一段時間內(nèi)細胞的增殖和細胞死亡非常重要。此外，我們可以通過熒光染料分子標記細胞后來描述其細胞的凋亡過程。

總結(jié)
我們利用不同細胞類型展示了幾種多參數(shù)分析方式，包括 iPSC 誘導(dǎo)人的心肌細胞，神經(jīng)細胞和肝細胞。獲得多參數(shù)能夠更好的區(qū)分描述不同細胞類型和化合物作用效果。此實驗全面的展示了 ImageXpress Pico 自動細胞成像系統(tǒng)和 CellReporterXpress 軟件可在基于細胞學(xué)實驗應(yīng)用方面。