剖析磁珠分離的學(xué)問(wèn)——Dynabeads 細(xì)胞分離與擴(kuò)增
Q1
對(duì)提升陰性分離法的靶細(xì)胞純度有何建議？
在此，我們整理了以下建議：
·良好的回收和純度基于高質(zhì)量的MNC制備，其中顆粒細(xì)胞和血小板的數(shù)量要低。
·在混勻步驟使用HulaMixer™樣品混合器（目錄編號(hào)15920D）以確保有足夠的抗體與靶細(xì)胞相結(jié)合。
·在抗體結(jié)合步驟之后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行良好的洗滌，以去除未結(jié)合的抗體。
·2X rosetting方案能夠提升細(xì)胞純度，而不增加分離過(guò)程中使用的Dynabeads™磁珠數(shù)量。
Q2
在陰性分離過(guò)程中，提升最終分選效率/得率的技巧是？
在此，我們整理了以下建議：
·樣本制備：所有的分離操作都必須在單細(xì)胞懸液中進(jìn)行。
·請(qǐng)確保使用了正確的細(xì)胞數(shù)量，稀釋倍數(shù)和抗體混合物體積，Dynabeads™磁珠和緩沖液系統(tǒng)。
·在混勻步驟使用HulaMixer™樣品混合器（目錄編號(hào)15920D）以確保分離操作中的混合效果良好。
·在接觸磁力架前的最后操作步驟中，用戶(hù)須使用1 mL槍頭吹打10次以上來(lái)將細(xì)胞/磁珠充分重懸。這一操作能夠幫助用戶(hù)捕獲滯留的目的細(xì)胞。
·配制分離和洗滌緩沖液的PBS應(yīng)不含Ca2+和Mg2+，以避免細(xì)胞發(fā)生補(bǔ)體活化或聚集。
Q3
在進(jìn)行單核細(xì)胞陰性分離時(shí)，遇到了細(xì)胞聚集的情況，該如何處理？
血小板激活經(jīng)常在單核細(xì)胞的分離過(guò)程中造成麻煩，因?yàn)榧せ詈蟮难“鍟?huì)結(jié)合單核細(xì)胞并產(chǎn)生單核細(xì)胞與血小板聚集的不利情況。有幾類(lèi)因子能夠引發(fā)血小板的激活效應(yīng)，如溫度改變，機(jī)械因素（即剪切力），暴露于抗凝劑肝素（通常存在于樣品管中）下，等等。為了避免血小板的活化（及后續(xù)的單核細(xì)胞聚集），這里提供一些應(yīng)遵循的常規(guī)建議：
·換用肝素之外的其它抗凝劑（如ACD，EDTA或檸檬酸鈉）。
·血樣應(yīng)保存于室溫直至制備MNC，MNC制備過(guò)程本身也應(yīng)該于室溫下進(jìn)行。
·應(yīng)輕柔地處理樣品，以最大程度地減少機(jī)械剪切力。如果可能，請(qǐng)使用注射器/針頭手動(dòng)滴入血樣，而不要使用Vacutainer™管，因?yàn)榇祟?lèi)樣品管中的真空條件通常會(huì)導(dǎo)致血小板與單核細(xì)胞的共同活化。
·檸檬酸鈉已知能夠“穩(wěn)定”血小板并避免其活化，同時(shí)包含——除作為抗凝劑的檸檬酸緩沖液之外——茶堿，腺苷和雙嘧達(dá)莫。
·請(qǐng)確保按照我們的實(shí)驗(yàn)方案來(lái)制備MNC，這些步驟專(zhuān)為獲得低血小板含量的MNC而設(shè)計(jì)。
Q4
收到的Invitrogen™ DETACHaBEAD™磁珠看起來(lái)外觀渾濁，這正常嗎？
是的，DETACHaBEAD™的外觀渾濁是正常的，由于其中的蛋白含量非常高，進(jìn)而可能出現(xiàn)蛋白沉淀現(xiàn)象。這并非細(xì)菌污染，不會(huì)影響分離與釋放細(xì)胞的回收率和活力。在使用前徹底混勻溶液。
Q5
針對(duì)DETACHaBEAD™產(chǎn)品的使用過(guò)程，是否有提升細(xì)胞得率的技巧？
在此，我們整理了以下建議：
·在使用前將DETACHaBEAD™溶液徹底混勻。
·獲得良好得率最為關(guān)鍵的參數(shù)是在孵育過(guò)程中DETACHaBEAD™溶液與樣品的混勻效果。我們推薦用戶(hù)采用能夠持續(xù)維持管體運(yùn)動(dòng)狀態(tài)、并讓樣品保持在管底以避免磁珠變干的混合器或旋轉(zhuǎn)儀（如HulaMixer™樣品混合器（目錄編號(hào)15920D））。
·減少細(xì)胞分離過(guò)程中的孵育時(shí)間（較低的親和力會(huì)提升釋放效率）。
·在與DETACHaBEAD™產(chǎn)品孵育后、放到磁力架吸附操作前，對(duì)磁珠結(jié)合的細(xì)胞上下吹打至少10次，以盡可能多的使磁珠從細(xì)胞上脫落。過(guò)于劇烈的吹打會(huì)降低細(xì)胞的活力。
·在操作過(guò)程中避免不必要的延遲。
Q6
在使用任意一款陽(yáng)性分離試劑盒分離細(xì)胞的過(guò)程中，怎樣才能提升細(xì)胞得率？
在此，我們整理了以下建議：
·樣本制備過(guò)程非常重要。所有的分離操作都必須在單細(xì)胞懸液中進(jìn)行。對(duì)于直接從全血樣本中分離某一類(lèi)型細(xì)胞（如單核細(xì)胞）的操作而言，我們推薦您在分離前對(duì)血樣進(jìn)行洗滌，以去除其中的干擾因素。
·對(duì)于指定了“混勻”操作的所有孵育過(guò)程而言，必須使用一款合適的混合器�？墒褂媚軌蛲瑫r(shí)提供傾斜和旋轉(zhuǎn)功能或倒轉(zhuǎn)混合功能的混合器（如HulaMixer™樣品混合器（目錄編號(hào)15920D））。
·如使用FlowComp™試劑盒，在加磁珠前先在細(xì)胞中加入抗體（間接法），則應(yīng)在加磁珠前通過(guò)洗滌去除過(guò)量的抗體。
·在與解離試劑孵育后，我們推薦您在將樣本放置到磁力架上之前，使用1 mL槍頭吹打樣品10次以上，以充分重懸樣本。
·用戶(hù)須在細(xì)胞分離過(guò)程中使用推薦的分離緩沖液。PBS中不可含有Ca2+和Mg2+，因?yàn)槎䞍r(jià)陽(yáng)離子會(huì)導(dǎo)致補(bǔ)體激活和細(xì)胞聚集。
·樣品中發(fā)生細(xì)胞聚集會(huì)同時(shí)嚴(yán)重降低細(xì)胞分離的得率和純度。
Q7
在使用 Invitrogen Dynabeads™Flowcomp™細(xì)胞分離試劑盒的過(guò)程中是否有提升細(xì)胞釋放效率的技巧？
在此，我們整理了以下建議：
·由于DSB-X 生物素-鏈霉親和素之間的結(jié)合隨著時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸變強(qiáng)；因此不要將釋放步驟的時(shí)間延長(zhǎng)至實(shí)驗(yàn)方案中規(guī)定的時(shí)間以上。在某些案例中，更短的孵育時(shí)間會(huì)獲得更高的得率。
·在與解離試劑孵育后，我們推薦您在將樣本放置到磁力架上之前，使用1 mL槍頭吹打樣品10次以上，以充分重懸樣本。
Q8
當(dāng)找不到適合自己的細(xì)胞類(lèi)型的陽(yáng)性分離試劑盒時(shí)，該怎么辦？
最佳的選擇是將Dynabeads™ FlowComp™ Flexi試劑盒與一款用于細(xì)胞分離的合適靶標(biāo)抗體聯(lián)用。Flexi試劑盒含有進(jìn)行分離和釋放操作所需的部分試劑，包括用于對(duì)您的抗體進(jìn)行生物素化操作的DSB-X生物素化試劑盒，經(jīng)修飾的鏈霉親和素包被的FLowComp™ Dynabeads™ 磁珠和FlowComp™ 釋放緩沖液。
Q9
是否有提升CELLLection™釋放步驟效率的通用技巧？
在此，我們整理了以下建議：
·請(qǐng)確保RPMI+1% FBS的pH值不要太高：DNA酶I在pH 7.0–7.4之間的效率最高（RPMI暴露于大氣環(huán)境中會(huì)導(dǎo)致pH值增加，pH指示劑會(huì)變紫）。
·請(qǐng)勿在DNA酶I的處理過(guò)程中使用RPMI+10% FCS。應(yīng)用10%的FBS會(huì)比1%的FBS獲得的細(xì)胞得率更低（可能由于一些批次的FBS中含有的DNA酶I抑制因子）。
·請(qǐng)確保緩沖液中含有DNA酶活性所需的Mg2+/Ca2+。
·DNA酶I必須溫和處理。劇烈攪拌DNA酶溶液會(huì)降低酶活性。一定不要對(duì)DNA酶溶液進(jìn)行渦旋操作。
·當(dāng)回收較低數(shù)量的細(xì)胞時(shí)，我們推薦您使用RPMI+1% FBS培養(yǎng)基預(yù)先包被管體，以減少細(xì)胞的損失（細(xì)胞很粘，容易在分選過(guò)程中貼附于管壁上）。
·DNA酶I在20°C條件下具有良好活性，不過(guò)，我們推薦用戶(hù)在DNA酶I的處理步驟之前將RPMI+1% FBS預(yù)熱至37°C，因?yàn)椴煌瑢?shí)驗(yàn)室的室溫并不相同。
·當(dāng)細(xì)胞與DNA酶釋放緩沖液孵育后，在使用磁力架分離之前對(duì)磁珠-細(xì)胞混合物進(jìn)行徹底的吹打非常重要，這樣可提供機(jī)械力打斷DNA連接。未仔細(xì)吹打細(xì)胞將會(huì)降低細(xì)胞的得率。
Q10
在CELLLection™生物素結(jié)合劑試劑盒或 CELLLection™ 通用型小鼠lgG試劑盒的應(yīng)用過(guò)程中，是否能提供一些提高得率的技巧？
在此，我們整理了以下建議：
·在CELLection™ Dynabeads™ 磁珠的包被過(guò)程中，對(duì)靶標(biāo)抗體的數(shù)量進(jìn)行滴定/優(yōu)化。
·如果目的細(xì)胞的數(shù)量很低，或細(xì)胞表面的靶標(biāo)抗原濃度很低，則推薦使用間接法技術(shù)。
·使用>1 x 10E7個(gè)磁珠/mL樣品（>25 μL）。
·在使用前對(duì)全血樣本進(jìn)行洗滌。
·為了確保獲得最高效率的細(xì)胞釋放效果，絕對(duì)不要在溶解凍干DNA酶的過(guò)程中渦旋DNA酶溶液。
·在釋放細(xì)胞的過(guò)程中，請(qǐng)將新鮮配制的RPMI/1% FCS預(yù)熱至37°C。
·確保緩沖液的pH值在7.0-7.4之間以獲得理想的DNA酶I活性。更高的pH值會(huì)抑制DNA酶的活性。
·RPMI中應(yīng)含有足量的Mg2+以幫助DNA酶發(fā)揮活性。
·當(dāng)細(xì)胞與DNA酶釋放緩沖液孵育后，在使用磁力架分離之前對(duì)磁珠-細(xì)胞混合物進(jìn)行徹底的吹打非常重要，這樣可提供機(jī)械力打斷DNA連接。未仔細(xì)吹打細(xì)胞將會(huì)降低細(xì)胞的得率。
Q11
在擴(kuò)增T細(xì)胞的過(guò)程中，為何使用Dynabeads™磁珠活化后細(xì)胞發(fā)生死亡？
提供一些保持細(xì)胞最優(yōu)生長(zhǎng)條件的提示：
·保持0.5– 1.5 x 10E6個(gè)細(xì)胞/mL的細(xì)胞最佳生長(zhǎng)密度非常重要。當(dāng)細(xì)胞密度超過(guò)1.5-2.5 x 10E6個(gè)細(xì)胞/mL時(shí)，就需要重新進(jìn)行刺激。
·請(qǐng)按照產(chǎn)品手冊(cè)中提供的磁珠:細(xì)胞比例，每8-12天重新刺激一次。
·請(qǐng)按照手冊(cè)中所提供每一產(chǎn)品特定的正確磁珠:細(xì)胞比例進(jìn)行活化操作。使用過(guò)量磁珠會(huì)抑制細(xì)胞活化/擴(kuò)增。
·使用優(yōu)化的細(xì)胞培養(yǎng)基，加入：
·生長(zhǎng)因子（IL-2，IL-7，IL-15，或其他細(xì)胞因子）
·促生長(zhǎng)添加劑（如人血清/FBS，L-谷氨酰胺/Glutamax，自由基清除劑（10 mM N-乙酰半胱氨酸））
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