分子篩定義

分子篩層析，又稱為凝膠過濾層析或體積排阻層析。分子篩層析是利用有一定孔徑范圍的多孔凝膠作為固定相，對混合物中各組分按分子大小進行分離的層析技術。具有分子篩作用的物質很多，如浮石、瓊脂、瓊脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝膠等。

避開原因一：工藝放大困難

分子篩層析無法遵循線性放大原則，即使遵循柱床高度不變的原則，工藝流速如何進行調整，也是需要面臨的問題。為保證良好的分離效果，分子篩層析必須要求相對較高的裝填高度，然而裝填高度偏高，反壓也勢必會偏高。由于層析填料的耐壓有限，在保證不超壓的前提下，工藝流速會明顯受限，這會使得整個純化過程時間漫長。


避開原因二：層析柱裝填困難

在進行層析柱裝填時，勻漿液濃度必須在一定的范圍內（50%-70%），方可保證沉降均勻、柱效良好，這對層析柱的規(guī)格選型有著特殊要求。高度100 cm的層析柱，在勻漿濃度50%-70%時，假設壓縮系數(shù)為1.15，則實際使用高度為43.5-60.9 cm，這往往無法達到某些使用者的要求。若選配裝柱器，并考慮柱頭所占空間，這要求實驗空間必須高度充足。若考慮將2根層析柱串聯(lián)使用，則要求2根層析柱的柱效相當，才可保證分離效果良好，這對裝填技術也有著較高要求。

避開原因三：測定柱效困難

常規(guī)柱效測定方法，要求平衡1.5-2 CV，進樣后，洗脫至出峰（參考值：2 CV），流速30 cm/h。若假設裝填高度為60 cm，平衡、洗脫體積總計3.5 CV，經(jīng)計算，測定一次柱效，需耗時7小時。可以想象，當發(fā)現(xiàn)柱效不理想，需要重新裝填并測定柱效時，過程是極為繁瑣、耗時的。


避開原因四：維護保養(yǎng)操作困難

當層析柱使用完畢，用20%乙醇保存時，同樣也極為耗時。而且當再次使用時，用水將20%乙醇置換走，一般需要3 CV以上，而且由于該過程反壓較大，通常還需要降低流速進行。

總之，采用分子篩層析，各個環(huán)節(jié)都極為繁瑣、耗時，因此，在進行層析工藝設計時，要盡量避開分子篩層析。


應用領域

分子篩層析也并非一無是處，其應用領域主要包括以下方面：

1）脫鹽：

高分子（如蛋白質、核酸、多糖等）溶液中的低分子量雜質，可以用分子篩層析除去，這一操作稱為脫鹽。本法脫鹽操作簡便、快速，蛋白質和酶類等在脫鹽過程中不易失活，樣品體積可達柱床體積的25%-30%，為了防止蛋白質脫鹽后溶解度降低會形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸銨等揮發(fā)性鹽類緩沖液使層析柱平衡，然后加入樣品，再用同樣緩沖液洗脫，收集的洗脫液用冷凍干燥法除去揮發(fā)性鹽類。

2）分離提純：

分子篩層析已廣泛用于酶、蛋白質、氨基酸、多糖、激素、生物堿等物質的分離提純。

3）測定高分子物質的分子量：

用一系列已知分子量的標準品放入同一凝膠柱內，在同一條件下層析，記錄每一分鐘成分的洗脫體積，并以洗脫體積對分子量的對數(shù)作圖，在一定分子量范圍內可得一直線，即分子量的標準曲線。測定未知物質的分子量時，可將此樣品加在測定了標準曲線的凝膠柱內洗脫后，根據(jù)物質的洗脫體積，在標準曲線上查出它的分子量。

4）高分子溶液的濃縮：

通常將Sephadex G-25或50干膠投入到稀的高分子溶液中，這時水分和低分子量的物質就會進入凝膠粒子內部的孔隙中，而高分子物質則排阻在凝膠顆粒之外，再經(jīng)離心或過濾，將溶脹的凝膠分離出去，就得到了濃縮的高分子溶液。