WHITE PAPER: Virotherapy Process Optimization

采用一系列方法將病毒工程開發(fā)用于疾病治療已經(jīng)成為一種新型的應(yīng)用，該應(yīng)用廣泛的定義為病毒療法，包括用于基因治療的病毒載體(Figure 1)和具有溶瘤細胞功能的病毒(Figure 2)。雖然這些產(chǎn)品大部分都處在臨床開發(fā)階段，但是藥物作用靶點的多樣性以及未來機會的財富都是令人鼓舞的。病毒療法是一門以病毒為基礎(chǔ)的技術(shù)，一個重要的挑戰(zhàn)就是在任何的時間點包括早期的研發(fā)，產(chǎn)品的生產(chǎn)，產(chǎn)品的包裝上市都能清楚地了解樣品的質(zhì)量和性能，其中最重要的一點就是病毒的定量。在過去，病毒的定量依賴于噬斑法和電鏡等方法，這些方法需要大量的勞動力，等待很長時間才能獲得結(jié)果，且獲得的結(jié)果具有很大的主觀性。然而，以新的病毒學技術(shù)的多樣性為基礎(chǔ)的病毒藥物和疫苗需要新的分析方法。在這篇文章中，我們將討論病毒計數(shù)儀3100實時的病毒濃度監(jiān)測功能如何能顯著的促進病毒療法產(chǎn)品的開發(fā)。

 

Reprogramming Viruses to Treat Disease

基因治療早在十幾年前就已經(jīng)出現(xiàn)，但是因為出過病人死亡的情況而受挫。幸運的是，在2006年基因治療在臨床上取得成功，所以基因治療又稱為大家研究的熱點。目前已經(jīng)有2000多個臨床試驗在許多不同的治療領(lǐng)域和標志中進行或者已經(jīng)完成。基因治療和其他病毒療法最大的區(qū)別在于基因治療會將人體的一段健康基因傳遞到病人細胞中取代一個非功能性的片段。依賴于此方法，這段健康基因可能會或者不會持續(xù)整合到宿主細胞基因組中。相反，溶瘤細胞的病毒可以利用許多方法去徹底破壞腫瘤細胞，而不是改變被感染細胞的基因組成。溶瘤細胞病毒療法包括裂解，刺激抗腫瘤免疫反應(yīng)，編碼能激活藥物前體成為有效細胞毒素的酶，抑制血管生成和放射療法敏化作用。

溶瘤細胞病毒療法的作用原理和機制如Figure2所示，該圖為Amgen公司所創(chuàng)，T-VEC 目前被用來研究黑色素瘤和其他晚期癌癥的治療，使用改進的皰疹病毒選擇性感染癌細胞，分泌細胞細胞因子刺激免疫反應(yīng)，已經(jīng)在三期臨床實驗中顯示了顯著的成效。除了癌癥，病毒療法也被建議用來治療其他疾病，如用噬菌體治療細菌感染。

到目前為止，許多的病毒已經(jīng)在病毒療法應(yīng)用中被評估過（見Table1）。

 

之所以選擇這些病毒，是因為他們只瞄準特定的細胞類型或者適合基因操作。為了把這些病毒開發(fā)成基因傳遞載體或者治療因子，必須將這些病毒放大培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中優(yōu)化培養(yǎng)條件以獲得最大的產(chǎn)量。在整個過程中如接種，體積放大培養(yǎng)，收樣，純化，濃縮，病毒包裝等都存在延誤、中斷的機會。由于許多病毒定量方法都需要好幾天甚至好幾周的時間，打斷整個流程，所以病毒定量是一個大的瓶頸。病毒計數(shù)儀3100(Figure 3)幾分鐘內(nèi)就能提供精確的，可重復(fù)的病毒顆粒定量結(jié)果，能實時監(jiān)測病毒的濃度。96孔板的自動上樣系統(tǒng)，為GMP要求設(shè)計的軟件能很好的滿足大規(guī)模的病毒生產(chǎn)環(huán)境所需的條件。

Figure 3. Virus Counter 3100 (top) and Autosampler (bottom)

Proof of Principle

病毒計數(shù)儀已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于多種病毒的計數(shù)，包括基因傳遞載體和溶瘤功能的病毒。這里我們列出一些檢測的數(shù)據(jù)，證實病毒計數(shù)儀快速的病毒定量在病毒療法領(lǐng)域的實用性。
病毒計數(shù)儀的精度通過檢測系列稀釋的病毒樣品數(shù)據(jù)斜率和線性關(guān)系來測量。這個值越接近1，說明這個機器產(chǎn)生的數(shù)據(jù)越可信，越能反映病毒濃度的真實性。

Figure 4證實了這個實驗，在這個案例中檢測的是水痘病毒。3個不同的樣品分別檢測了11稀釋度，斜率分別為－1.0845，－1.0846，－1.14，R2分別是0.995, 0.997 and 0.996，顯示出良好的精確性。
Figure 4. Quantification of serial dilutions of Vaccinia virus usingthe Virus Counter.

在下一個例子中，一個客戶想跟蹤HeLa細胞培養(yǎng)的麻疹病毒的濃度。他們采用病毒計數(shù)儀測量總的病毒顆粒，用TCID50（這個方法需要5-7天的時間）測量病毒的感染性,并比較了兩者之間的關(guān)系（Figure5）。與大部分的病毒類似，有感染能力的麻疹病毒的數(shù)量只是總的病毒群體中的一小部分，在這個例子中只有0.6% to 1.7%，暗示了此批次培養(yǎng)的病毒大部分是非感染性的病毒。有趣的是，在病毒感染后，細胞培養(yǎng)了120多個小時后，感染性病毒數(shù)量明顯下降，而病毒總量卻保持穩(wěn)定不變，暗示病毒的感染效力會受到培養(yǎng)時間延長的不利影響。

Figure 5. Comparison of total particle count (Virus Counter) andinfectivity (TCID50) of Measels virus grown in HeLa cells.

此外，利用病毒計數(shù)儀跟蹤定量麻疹病毒在純化的每個步驟中病毒顆粒的濃度（Figure 6）該實驗闡明了病毒的實時定量在病毒純化優(yōu)化，避免錯誤發(fā)生的重要性。沒有病毒計數(shù)儀的實時監(jiān)測，任何人在生產(chǎn)病毒療法的藥劑時都是在黑暗中摸索，冒著百萬美元損失以及需要安全有效產(chǎn)品進行治療的病人的健康風險。

Figure 6. Tracking virus particle counts during harvest and purification.

 
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