外周血單個核細(xì)胞（PBMC）在免疫學(xué)、傳染病、腫瘤學(xué)、干細(xì)胞移植、惡性血液腫瘤以及疫苗開發(fā)等領(lǐng)域被廣泛的研究，尤其是在免疫學(xué)領(lǐng)域，PBMC細(xì)胞被用來監(jiān)測在不同患者之間的免疫功能，其監(jiān)測濃度、活力、增值、細(xì)胞因子的功能，對于臨床試驗和細(xì)胞醫(yī)學(xué)研究都是是至關(guān)重要的。

PBMC通常從分離于全血或者采集于病人的臍帶血，這個過程就需要使用淋巴細(xì)胞分離液從血漿，血小板，和紅細(xì)胞（RBC）中分離PBMC。分離之后，冷凍保存之前或者各種免疫分析都需要進(jìn)行常規(guī)的活性和濃度測驗來驗證樣品的質(zhì)量。

其中一個重要的問題就是PBMC細(xì)胞分離中紅細(xì)胞的污染，PBMC樣品中紅細(xì)胞的污染會導(dǎo)致測量濃度和活性的誤差，這就需要通過進(jìn)一步的實驗來分析這些細(xì)胞，要解決這個問題，可以用RBC溶解來消除潛在的RBC污染導(dǎo)致的問題。

 

1、新鮮的人類PBMC樣品殘留RBC的鑒定

用Cellometer Vision細(xì)胞計數(shù)儀明場圖像計數(shù)15個分離的新鮮白細(xì)胞樣品，獨特的光學(xué)系統(tǒng)使得紅細(xì)胞的雙凹面可視化，因此PBMC和RBC被視覺化然后圖像計數(shù)。因此PBMC和RBC可以被視覺識別，然后根據(jù)圖像計數(shù)。

下圖顯示的是明場計數(shù)的PBMC樣品，紅色圈圈出雙凹面的紅細(xì)胞，藍(lán)色圈圈出PBMC

          

VISION CBA調(diào)焦，紅細(xì)胞雙凹面結(jié)構(gòu)明場圖像         熒光染料染PBMC確認(rèn)，紅箭頭為雙凹的紅細(xì)胞，綠箭頭為PBMC

 

紅色圈圈出紅細(xì)胞，藍(lán)色圈圈出PBMC

 

RBC的污染程度用公式計算：污染率%=RBC計數(shù)/總計數(shù)×100%

結(jié)果顯示4個樣品高度污染（超過30%），6個樣品中度污染（介于10%-30%），4個樣品低輕度污染（低于10%）。

 

2、AO/PI雙染活/死細(xì)胞進(jìn)行自動計數(shù)

AO和PI是熒光核酸染料，檢測細(xì)胞的活性。AO是一種細(xì)胞膜透過性染料，染總細(xì)胞，發(fā)綠色熒光;，PI不具有細(xì)胞膜通透性，染死細(xì)胞，發(fā)橙/紅色熒光。當(dāng)死細(xì)胞同時包含了AO和PI，發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，AO發(fā)散的熒光被PI吸收，因此，只有活細(xì)胞才發(fā)綠色熒光。此外，成熟的血小板和紅細(xì)胞是無核的，不能被熒光染料著色，完全排除。AO/PI混合液20ul和白細(xì)胞樣品20ul，按照1：1的比例混合，通過Cellometer細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)PBMC濃度。

 

3、通過AO/PI檢測PBMC細(xì)胞活力

為了驗證AO/PI雙染法精確計數(shù)總PBMC，從全血中分離了5個新鮮的白細(xì)胞樣品，3%的醋酸溶解，然后臺盼藍(lán)染色人工計數(shù)對比AO/PI雙染法

樣品A：加AO/PI，然后直接通過Cellometer雙熒光細(xì)胞計數(shù)儀進(jìn)行自動計數(shù)

樣品B：3%的醋酸裂解紅細(xì)胞，然后臺盼藍(lán)染色，計數(shù)。

兩種方法對比，結(jié)果顯示，AO/PI雙染法能夠不用裂解RBC進(jìn)行總PBMC計數(shù)和活力分析。

 

 

4、AO/PI雙染色法排除RBC污染導(dǎo)致的計數(shù)誤差

使用血球計數(shù)板手工計數(shù)和AO/PI雙染自動計數(shù)兩種方法，進(jìn)行15個PBMC樣品的計數(shù)。其中手工計數(shù)的操作者為經(jīng)驗豐富的計數(shù)方面專家，可以憑豐富的經(jīng)驗及不斷微調(diào)顯微鏡焦距區(qū) 分出紅細(xì)胞和PBMC。

 

如圖所示，手工計數(shù)法為藍(lán)色柱條，AO/PI雙染自動計數(shù)法為綠色柱條。AO/PI雙染法沒有受到高度RBC污染的影響，可以精確計數(shù)PBMC。而手工計數(shù)需要靠經(jīng)驗豐富的操作者一個一個的判斷紅細(xì)胞和PBMC。此結(jié)果顯示AO/PI雙染自動計數(shù)和經(jīng)驗豐富的操作者進(jìn)行的手工計數(shù)計數(shù)PBMC的結(jié)果一致。

同時，15個樣本中分離的結(jié)果差異很大，不同人尤其不同病人分離后紅細(xì)胞RBC污染的差異大。

 

RBC污染極大的影響PBMC樣品的濃度和活性的精確性，RBC污染的程度在不同病人之間有差異，標(biāo)準(zhǔn)的PBMC處理protocol無法區(qū)分，只有AOPI雙熒光自動細(xì)胞計數(shù)儀能夠快速、高效、精確進(jìn)行PBMC計數(shù)和活力分析，有助于免疫學(xué)的研究。

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