xCELLigence系統(tǒng)持續(xù)檢測神經(jīng)細胞培養(yǎng)

Sebastian Diemert, Julia Grohm, Svenja,Tobaben, Amalia Dolga, Carsten Culmsee
德國，馬爾堡大學(xué)，藥理學(xué)與臨床藥學(xué)研究所

    摘要：為了研究類神經(jīng)元細胞HT-22，及原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細胞對不同細胞死亡刺激物的反應(yīng)，我們使用由羅氏與ACEA Biosciences公司聯(lián)合開發(fā)的實時細胞分析儀（Real-Time Cell Analyzers，RTCA）xCELLigence系統(tǒng)，應(yīng)用非侵入式、無標記性技術(shù)，對類神經(jīng)元細胞HT-22進行持續(xù)監(jiān)測。研究表明，通過對細胞形態(tài)學(xué)改變、細胞粘附與細胞增殖的監(jiān)測，xCELLigence系統(tǒng)可對神經(jīng)細胞培養(yǎng)進行持續(xù)監(jiān)測并追蹤細胞的變化及其死亡情況。

關(guān)鍵詞：神經(jīng)細胞死亡、xCELLigence系統(tǒng)、原代皮質(zhì)神經(jīng)元細胞、HT-22 細胞、細胞阻抗、實時測定

前言

    在很多神經(jīng)退化性疾病中發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)元凋亡與壞死。近幾年來，神經(jīng)科學(xué)研究中建立了幾種細胞培養(yǎng)模式，用于體外細胞死亡機制的研究。盡管近年來科學(xué)界對神經(jīng)元細胞死亡信號傳導(dǎo)原理已經(jīng)得了一定成果，但技術(shù)上的局限性依然存在，從而限制了對數(shù)據(jù)的采集與解讀。而無法進行神經(jīng)細胞死亡的實時監(jiān)測是一個主要的技術(shù)瓶頸。目前為止，主要的細胞增殖、細胞生存與細胞死亡檢測方法均為侵入式終點檢測，通常對細胞有毒性，并需要對細胞進行破壞處理。
    同時，對神經(jīng)細胞死亡與潛在機制進行動態(tài)變化分析，需要大量的實驗操作，涵蓋持續(xù)的、多個時間點。目前有幾種終點實驗法，可進行特定凋亡時間點上的特異性分子事件的檢測，如磷脂酰絲氨酸轉(zhuǎn)位至細胞膜外部，線粒體功能障礙、半胱氨酸蛋白酶激活，以及 DNA 斷裂[1]。這些終點測定的一個缺陷是，其無法確定實驗凋亡時間點。為解決這個問題，研究人員需要重復(fù)對細胞死亡形態(tài)學(xué)改變進行監(jiān)測。
    目前，使用由羅氏與 ACEA Biosciences公司聯(lián)合開發(fā)的實時細胞分析儀（Real-Time Cell Analyzers，RTCA）xCELLigence系統(tǒng)，應(yīng)用非侵入式、無標記性技術(shù)，可對細胞進行持續(xù)監(jiān)測。xCELLigence系統(tǒng)對將傳感器微電極點陣整合入E-Plate 96培養(yǎng)孔底部，并對生長于上的細胞阻抗進行記錄。阻抗測定記錄的是細胞指數(shù)（Cell Index，CI）值，細胞貼附于電極后，當(dāng)細胞形態(tài)學(xué)發(fā)生變化，會導(dǎo)致電流環(huán)路電阻改變，該電阻與細胞指數(shù)具有相關(guān)性。通過對細胞形態(tài)學(xué)改變、細胞粘附與細胞增殖的監(jiān)測，xCELLigence 系統(tǒng)可追蹤細胞變化與細胞死亡情況。
    本研究中，我們使用xCELLigence系統(tǒng)，對類神經(jīng)元細胞HT-22，及原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細胞，對不同細胞死亡刺激物的反應(yīng)進行了研究。原代培養(yǎng)神經(jīng)細胞的一個特征是其濃密的樹突狀網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)在凋亡誘導(dǎo)后，可殘留于組織反應(yīng)板上。無論細胞本身是否已發(fā)生凋亡，凋亡神經(jīng)元可殘留貼附于細胞培養(yǎng)板上，并顯示出一定的阻抗性。這種特性對原代神經(jīng)元培養(yǎng)監(jiān)測的影響，也是本次使用RTCA儀器進行研究的一個熱點。而且，我們對xCELLigence系統(tǒng)對神經(jīng)保護作用的監(jiān)測能力進行了研究。出于這個目的，我們使用神經(jīng)保護劑BI-6C9，BI-6C9是一種公認的BH-3 小分子抑制劑，可與死亡激動劑（domain death agonist，BID）發(fā)生相互作用，是Bcl-2基因家族的預(yù)凋亡成員[4, 5]。
    總之，研究表明，xCELLigence系統(tǒng)可通過多方面實驗，持續(xù)對神經(jīng)細胞培養(yǎng)進行監(jiān)測，所進行的實驗包括接種反應(yīng)板、預(yù)培養(yǎng)、增殖膠質(zhì)細胞的去除、藥物作用，以及對神經(jīng)毒性與神經(jīng)保護作用的確認。

1 材料與方法
1.1 HT-22類神經(jīng)元細胞
    按照指定密度接種HT-22細胞于96孔 E-反應(yīng)板96（羅氏）或常規(guī)96-孔反應(yīng)板（Greiner，F(xiàn)rickenhausen）上，并生長于DMEM培養(yǎng)基（德國 Karlsruhe, Invitrogen 公司）中，培養(yǎng)基中添加有10%熱失活胎牛血清（FCS）、100 U/ml 青霉素、100 µg/ml鏈霉素與2 mM 谷氨酸（德國 PAA Laboratories 有限公司）。
1.2 原代皮質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng)
    如前述，原代皮質(zhì)神經(jīng)元細胞來自于胎鼠大腦（E16-18）[4]。簡言之，即分離皮質(zhì)組織、輕柔胰酶消化后，機械分離神經(jīng)元，并去除腦膜。將不同密度細胞接種于聚乙烯亞胺 （polyethylenimine，PEI） 預(yù)包被 96-孔 E-Plates 96（Roche）或標準 96-孔板（Greiner）中。培養(yǎng)基為神經(jīng)細胞培養(yǎng)基 （Invitrogen） 添加有5mM HEPES、1.2 mM 谷氨酸、2% （v/v） B27 補充劑（Invitrogen）與慶大霉素（0.1 mg/ml）。培養(yǎng) 48 小時后，使用胞嘧啶-阿糖胞苷（cytosine-arabinofuranoside，CAF）處理 48 小時，抑制非神經(jīng)元細胞的生長。然后，體外培養(yǎng) 6-7 天后，完全更換培養(yǎng)基，將神經(jīng)元細胞用于下述實驗。為對谷氨酸處理神經(jīng)元細胞CI 值的改變進行監(jiān)測，必須于培養(yǎng)第0天，于細胞中添加 1 µM CAF。
1.3 細胞增殖檢測
    根據(jù)細胞增殖試劑盒I（MTT）（羅氏）的說明書，通過比色MTT（3-[4,5-二甲基砷-2-yl] -2,5-溴化噻唑藍四氮唑） 檢測，對神經(jīng)元細胞活性進行檢測。通過自動FLUOstar Optima 讀取儀（德國 Offenburg ，BMG Labtech）進行 570 nm培養(yǎng)孔的吸光度讀取，參考過濾波長是 630 nm。
1.4 實時細胞分析
    使用 xCELLigence RTCA MP 儀器與 RTCA 軟件1.2 進行 CI 值測定，并于 E-Plate 96 中進行持續(xù)監(jiān)測。用100 µl DMEM含10% FCS進行HT-22細胞培養(yǎng)的背景阻抗檢測，用100 µl 神經(jīng)細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基含2% B27進行神經(jīng)細胞培養(yǎng)的背景阻抗檢測。PEI 包被不會干擾細胞阻抗測定。相反，多聚-D-賴氨酸或多聚-L-賴氨酸包被可顯著干擾原代皮質(zhì)神經(jīng)元的實時監(jiān)測。對 HT-22 細胞持續(xù)監(jiān)測 2 天，對原代皮質(zhì)神經(jīng)元細胞持續(xù)檢測 12-14 天。
1.5 熒光與光學(xué)顯微鏡
    在PEI包被 IbiTreat µ-Slide 8-孔反應(yīng)板（德國Munich，Ibidi） 上培養(yǎng)皮質(zhì)神經(jīng)元細胞，培養(yǎng) 6 天。然后，將培養(yǎng)細胞固定于 +4°C 磷酸緩沖液（PBS）（pH 7.4） 多聚甲醛中。使用 0.2% Triton X-100/PBS 對神經(jīng)元細胞進行透化處理，使用 10% （v/v） 標準山羊血清（NGS）與2% （v/v） 牛血清白蛋白 （BSA）PBS，于室溫處理 1 小時進行終止。+4°C 環(huán)境下，將神經(jīng)元細胞與神經(jīng)元標志微管相關(guān)蛋白2 (microtubule-associated protein 2，MAP-2） （英國劍橋Abcam, ab11267, HM-2, 1:600 稀釋）小鼠單克隆抗體共同孵育，孵育過夜。第2 天，將細胞與山羊抗小鼠二抗（Alexa Fluor® 488 goat anti-mouse IgG （H+L） (Invitrogen, 1:250 稀釋）共同孵育。使用DMI6000 B 倒置顯微鏡（德國，Leica ）收集熒光成像信息，LAS AF 軟件（德國Mannheim，Leica Microsystems 公司Leica Application Suite, Advanced Fluorescence 2.2.0）分析。使用配備有 Lumenera Infinity 2 數(shù)字攝象機（加拿大 Ottawa，Lumenera 公司）的Axiovert 200 顯微鏡（德國 Jena ，Carl Zeiss ）獲取光學(xué)顯微鏡的成像信息。10x 2.5 NA 物鏡 （德國 Jena ，Carl Zeiss）采光，通過相差進行成像捕獲。INFINITY ANALYZE 軟件 （Lumenera 公司） 數(shù)字成像記錄與成像分析。

3 結(jié)果
3.1 神經(jīng)元 HT-22 細胞增殖
    為對神經(jīng)細胞系 HT-22 的生長與增殖情況進行評價，將細胞以不同密度（4500、8000 
與 20000 細胞每孔） 接種于 E-Plate 96 上，并使用xCELLigence RTCA MP 儀器進行監(jiān)測，監(jiān)測 48 小時。首先細胞粘附于培養(yǎng)孔表面后，阻抗會顯著增加，后期實驗中，HT-22 細胞增長穩(wěn)定。最終的各生長曲線，斜率非常相似，僅各培養(yǎng)孔絕對 CI 值不同，CI 值隨各自接種密度的（參見圖 1A 與 B）不同而不同。

    為進行 HT-22細胞死亡誘導(dǎo)，使用不同劑量的谷氨酸（3 與 5 mM）。這些細胞中，谷氨酸可導(dǎo)致谷氨酰胺的消耗，從而促進活性氧的生成，導(dǎo)致線粒體損傷與細胞死亡[2, 3]。谷氨酸處理后 8-10 小時期間，未檢測到 CI 值改變。其后 4-6 小時期間，CI 值快速降低。阻抗曲線圖反映出劑量依賴性的谷氨酸誘導(dǎo)的細胞死亡。阻抗測定后的E-Plate 96 反應(yīng)板 MTT 實驗結(jié)果進一步證實了本研究結(jié)果（參見圖1C）。不同細胞接種密度與不同谷氨酸濃度下，細胞死亡的開始時間略有不同。如圖 1B，xCELLigence記錄阻抗圖在藥物給定時間點，對CI 值進行標準化。xCELLigence系統(tǒng)檢測到的谷氨酸誘導(dǎo)的細胞死亡動態(tài)變化，同前期研究中谷氨酸誘導(dǎo)HT-22 細胞死亡的時間段及特征具有良好的重復(fù)性，包括線粒體斷裂與細胞核 AIF 轉(zhuǎn)位[2, 3, 4]。

3.2 CELLigence系統(tǒng)神經(jīng)保護作用檢測
    為測定xCELLigence 系統(tǒng)是否可檢測神經(jīng)保護作用，我們使用預(yù)凋亡BH-3 蛋白BID的小分子抑制劑，即 BI-6C9，來防止谷氨酸對 HT-22 細胞的毒性作用。如圖 2A 所示，在HT-22細胞預(yù)先添加 3 mM或5 mM的谷氨酸的情況下，BI-6C9可有效防止谷氨酸誘導(dǎo)的 HT-22 細胞的凋亡。儀器記錄的 BI-6C9 處理的細胞，無論是否添加谷氨酸，其CI 值均持續(xù)增加，表明BI-6C9 可維持細胞形態(tài)并延長細胞生存時間。而且使用實驗終止后的E-Plate 96 孔板，及在實驗時平行設(shè)置的附加標準 96 孔板，進行細胞增殖（MTT）實驗 ，均驗證了BI-6C9-介導(dǎo)的保護作用（參見圖 2B）。這些結(jié)果進一步證實了xCELLigence系統(tǒng)
    可用于監(jiān)測細胞活性。通過光學(xué)顯微鏡觀察，將藥物對 HT-22 細胞形態(tài)學(xué)的作用進行記錄（參見圖 2C）。添加谷氨酸后，細胞發(fā)生顯著形態(tài)學(xué)改變，細胞固縮并從培養(yǎng)板脫落，阻抗降低。通過 xCELLigence 系統(tǒng)相應(yīng) CI 值監(jiān)測記錄，進一步證實了這種情況，監(jiān)測記錄表明，谷氨酸處理后，CI 值降低。然而在添加 BI-6C9 后，HT-22 細胞形態(tài)未改變，CI 值記錄進一步證實了神經(jīng)保護的作用（參見圖 2A）。