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                                當(dāng)前位置 > 首頁(yè) > 技術(shù)文章 > UP.SIGHT 2.0 雙重驗(yàn)證技術(shù)賦能單克隆細(xì)胞株開(kāi)發(fā),單克隆性超99.99%

                                UP.SIGHT 2.0 雙重驗(yàn)證技術(shù)賦能單克隆細(xì)胞株開(kāi)發(fā),單克隆性超99.99%

                                瀏覽次數(shù):230 發(fā)布日期:2025-2-14  來(lái)源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責(zé)任自負(fù)
                                單克隆細(xì)胞株的開(kāi)發(fā)在生物制藥生產(chǎn)(如單克隆抗體制備)中占據(jù)關(guān)鍵地位。為了確保產(chǎn)品的一致性,所使用的細(xì)胞株必須來(lái)源于單個(gè)細(xì)胞。常見(jiàn)的克隆工作流程通常包括一至兩輪的單細(xì)胞克隆,隨后通過(guò)孔板成像確認(rèn)單細(xì)胞是否成功分配。然而,傳統(tǒng)的有限稀釋法或流式細(xì)胞術(shù)等方法并不能有效驗(yàn)證是否僅分配了單個(gè)細(xì)胞,這使得單克隆性的確認(rèn)過(guò)于依賴孔板成像的準(zhǔn)確性?装宄上裨诩(xì)胞檢測(cè)時(shí)存在固有誤差,同時(shí)需要依賴離心操作以確保所有細(xì)胞位于成像焦平面內(nèi)。這些誤差的累積降低了在特定工作流程中實(shí)現(xiàn)單克隆性的可能性,因此,高精度的成像技術(shù)和檢測(cè)方法顯得尤為重要。
                                 
                                UP.SIGHT 2.0 (影像式單細(xì)胞打印與成像系統(tǒng))通過(guò)雙重驗(yàn)證機(jī)制有效解決了細(xì)胞分配中的挑戰(zhàn)。該系統(tǒng)的第一次驗(yàn)證是通過(guò)一系列噴嘴圖像記錄單細(xì)胞的分離情況,第二次驗(yàn)證則采用3D全孔成像技術(shù)直接捕獲液體體積的圖像。這種3D成像技術(shù)能夠完整捕捉液體體積,從而避免了克隆后所需的離心操作。此外,UP.SIGHT 2.0還支持菌落生長(zhǎng)后的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè),兼容96、384和1536孔板,適用于高通量工作流程,且單細(xì)胞分配效率超過(guò)98%。

                                圖1. UP.SIGHT 2.0
                                 
                                本研究分析了4000個(gè)單細(xì)胞和近1000個(gè)生長(zhǎng)的菌落,結(jié)果表明:結(jié)合噴嘴圖像與3D全孔成像,細(xì)胞株的單克隆性概率超過(guò)99.99%,且無(wú)需依賴熒光染色或成像技術(shù)。
                                 

                                結(jié)果展示
                                1. 在一個(gè)設(shè)備中提供單細(xì)胞分配、孔內(nèi)驗(yàn)證和菌落跟蹤功能
                                UP.SIGHT 2.0為克隆、克隆驗(yàn)證和追蹤提供了一個(gè)完整的工作流程(圖2)。流程的第一步是將細(xì)胞懸浮液加載到設(shè)備中的一次性墨盒中。在單細(xì)胞分配過(guò)程中,噴嘴會(huì)生成微型自由飛行液滴,并持續(xù)進(jìn)行成像(圖2.1)。圖像處理算法實(shí)時(shí)評(píng)估即將到來(lái)的液滴,判斷其是否包含0、1或多個(gè)細(xì)胞。如果液滴被判定為包含0、多個(gè)細(xì)胞,或盡管只含一個(gè)細(xì)胞但其特征(如大小、圓度或熒光強(qiáng)度)不符合預(yù)設(shè)標(biāo)準(zhǔn),該液滴將被丟棄。相反,若檢測(cè)到1個(gè)單細(xì)胞,且該細(xì)胞的大小、圓度和熒光強(qiáng)度等均符合標(biāo)準(zhǔn),則該細(xì)胞將被分配至孔板中。針對(duì)每個(gè)成功分配的單細(xì)胞,系統(tǒng)會(huì)生成五張圖像,以確認(rèn)單細(xì)胞的分離與排出情況。分配完成后,使用孔板下方的第二臺(tái)相機(jī)進(jìn)行 3D 全孔成像,捕獲孔中的一系列圖像(圖2.2),這一成像設(shè)備為目標(biāo)孔中分配的單細(xì)胞提供了二次確認(rèn)。
                                 
                                3D全孔成像捕獲的圖像數(shù)量取決于板的類(lèi)型和孔中介質(zhì)的體積,這種成像方式消除了對(duì)孔板進(jìn)行離心的需求。由于成像是細(xì)胞在介質(zhì)中沉降時(shí)進(jìn)行的,而細(xì)胞通常位于液體體積的上半部分,因此與僅在孔底進(jìn)行第0天成像相比,這種方式大大減少了由于板或邊緣效應(yīng)造成的畸變影響,從而提升了細(xì)胞檢測(cè)的準(zhǔn)確性。
                                 
                                在克隆后的階段,UP.SIGHT 2.0能夠?qū)哂欣硐肷L(zhǎng)曲線的特定克隆進(jìn)行成像并追蹤其群體生長(zhǎng)(圖2.3)。圖3展示了一個(gè)經(jīng)過(guò)驗(yàn)證為源自單個(gè)細(xì)胞的群體,該驗(yàn)證是通過(guò)噴嘴影像及第0天的3D全孔成像完成。展示了細(xì)胞在底部沉淀后的狀態(tài),以及在分配事件后的第1天、第4天和第7天所拍攝的后續(xù)影像。整個(gè)成像過(guò)程快速且高效,僅需約3分鐘即可處理一個(gè)384孔的板,從而實(shí)現(xiàn)后續(xù)的高通量群體追蹤。 
                                 

                                圖2.UP.SIGHT 2.0對(duì)于每個(gè)孔的工作流程
                                1)通過(guò)噴嘴成像可以驗(yàn)證分配的液滴中僅包含單個(gè)細(xì)胞,2)對(duì)分配后的孔進(jìn)行一系列3D全孔成像,以做第二次驗(yàn)證,3)對(duì)隨時(shí)間生長(zhǎng)的菌落進(jìn)行成像以確?寺⌒缘囊恢滦浴
                                 

                                圖3.UP.SIGHT在菌落生長(zhǎng)追蹤中的應(yīng)用,分別為第0、1、4和7天的菌落成像。
                                 
                                2. 噴嘴圖像與3D全孔成像相結(jié)合,為單克隆性細(xì)胞分配提供了多重保證
                                噴嘴圖像與3D全孔成像的結(jié)合進(jìn)一步驗(yàn)證了細(xì)胞在孔板中的分布情況。與有限稀釋法或流式細(xì)胞術(shù)等傳統(tǒng)方法相比,UP.SIGHT 2.0在單細(xì)胞分配過(guò)程中提供了更可靠的驗(yàn)證,單細(xì)胞分配效率超過(guò)98%。然而,算法在某些情況下可能會(huì)誤判為僅分配了一個(gè)細(xì)胞,而實(shí)際上可能是兩個(gè)相互粘連的細(xì)胞。因此,引入3D全孔成像為單細(xì)胞分配的確認(rèn)提供了第二種方法,以確保僅有一個(gè)細(xì)胞被分配。
                                 
                                圖4展示了兩個(gè)噴嘴圖像及其相應(yīng)的3D全孔成像示例。在這些示例中,紅色和綠色CHO細(xì)胞被混合并分配,所形成的菌落也被熒光成像儀捕捉到。在圖4.1中,噴嘴圖像清晰顯示僅選擇了一個(gè)細(xì)胞,3D全孔成像顯示的單個(gè)細(xì)胞和單色菌落進(jìn)一步驗(yàn)證了這一點(diǎn),證實(shí)這是一個(gè)單克隆細(xì)胞系。而在圖4.2中,僅憑噴嘴圖像難以確認(rèn)是否僅選擇了一個(gè)細(xì)胞,而3D全孔成像則清楚地證實(shí)分配了兩個(gè)細(xì)胞,并且這兩個(gè)細(xì)胞分別生成了紅色和綠色的菌落。在這個(gè)例子中,噴嘴圖像與3D全孔成像的結(jié)合幫助判定這是一個(gè)非克隆的細(xì)胞群體,并將其排除在進(jìn)一步分析之外。
                                 

                                圖4.UP.SIGHT通過(guò)噴嘴和3D全孔成像為克隆性提供多種保證
                                 
                                3. 實(shí)現(xiàn)>99.99%的單克隆概率
                                為確定UP.SIGHT 2.0實(shí)現(xiàn)單克隆性的概率,我們計(jì)算了噴嘴圖像和3D全孔成像相關(guān)的誤差率。本研究采用紅色和綠色1:1混合的CHO細(xì)胞,評(píng)估單細(xì)胞分配和3D全孔成像的錯(cuò)誤率。
                                 
                                根據(jù)噴嘴圖像將4000多個(gè)細(xì)胞分配到孔板中,以確定噴嘴圖像的誤差率。驗(yàn)證孔板中的細(xì)胞后發(fā)現(xiàn),41個(gè)孔實(shí)際上包含兩個(gè)細(xì)胞,因此可以確認(rèn)噴嘴圖像的誤差率為1.0%。
                                 
                                對(duì)于3D全孔成像的誤差率,我們保留了一部分孔板用于菌落評(píng)估,并將3D全孔圖像中標(biāo)記為單個(gè)細(xì)胞的孔與實(shí)際獲得的菌落進(jìn)行比較。紅色和綠色細(xì)胞均被沉積,因此任何含有多色菌落的孔都表明存在3D全孔成像誤差。經(jīng)過(guò)評(píng)估,1800多個(gè)孔中得出了991個(gè)菌落,其中有2個(gè)混合顏色的菌落被錯(cuò)誤分類(lèi)。由此,3D全孔成像的誤差率估計(jì)為0.7%。將這兩個(gè)誤差率相乘,得出UP.SIGHT 2.0提供的單克隆性概率超過(guò)99.99%。盡管在3D全孔圖像中無(wú)法將兩個(gè)混合顏色的菌落識(shí)別為非克隆菌落,但在相應(yīng)的噴嘴圖像中,這兩個(gè)孔均能被識(shí)別為非克隆。
                                 
                                4. 部分3D全孔成像不僅提供了>99.99%的單克隆性概率,還顯著提升了成像速度
                                在3D全孔成像過(guò)程中,細(xì)胞聚焦的圖像堆疊位置在各孔板之間保持一致。此過(guò)程中共獲取了81張圖像,以全面覆蓋孔體積。對(duì)1500多個(gè)孔的評(píng)估顯示,細(xì)胞的平均位置位于圖像堆疊的第65層(圖像1為孔底,圖像81為液體頂部),其標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.2,最小值為第45張圖像。這些變化主要源于孔底高度的不一致及移液過(guò)程中的誤差。由于細(xì)胞沉降速度較慢,細(xì)胞在分配后不太可能立即位于孔板的下部。因此,可以省略對(duì)孔底的成像,從中間層開(kāi)始拍攝至液體頂部,從而有效減少處理時(shí)間,同時(shí)保持較高的單克隆性概率。表2展示了384孔板示例中每個(gè)孔的細(xì)胞聚焦圖像堆疊位置。盡管捕獲了81張圖像,但從液體體積中心開(kāi)始的40幅圖像已足以捕捉所有細(xì)胞,并實(shí)現(xiàn)與3D全孔成像相同的單克隆性概率。表3對(duì)不同工作流程進(jìn)行了比較,展示了各自的處理時(shí)間和單克隆性概率。
                                 
                                表2.在3D全孔成像中,從液體體積中心成像仍然可以捕獲細(xì)胞,并保持高概率的單克隆性。81張圖像覆蓋整個(gè)體積,細(xì)胞通常在圖像55至70間可見(jiàn)。由于細(xì)胞沉降緩慢,僅需從中心開(kāi)始的40張圖像,無(wú)需評(píng)估孔的下半部分。
                                 

                                表3.工作流程處理時(shí)間的比較
                                 

                                實(shí)驗(yàn)結(jié)論
                                 
                                UP.SIGHT 2.0是一種多功能設(shè)備,具備單細(xì)胞的分離、驗(yàn)證與菌落生長(zhǎng)監(jiān)測(cè)能力。其創(chuàng)新的3D全孔成像技術(shù)為每個(gè)孔提供全面的液體體積成像,完全不依賴離心孔板進(jìn)行單細(xì)胞分配驗(yàn)證,這一創(chuàng)新顯著提升了實(shí)驗(yàn)的靈活性和準(zhǔn)確性。
                                 
                                通過(guò)對(duì)單細(xì)胞的成像與記錄,UP.SIGHT 2.0為克隆性驗(yàn)證提供了可靠的雙重保障。以上研究對(duì)超過(guò)4000個(gè)單細(xì)胞進(jìn)行了深入驗(yàn)證,結(jié)果顯示該工作流程實(shí)現(xiàn)了超過(guò)99.99%的單克隆率。此外,部分3D全孔成像結(jié)果顯示,單克隆性的概率也超過(guò)99.99%,并且成像速度顯著提高,這進(jìn)一步增強(qiáng)了實(shí)驗(yàn)效率和可靠性。
                                 
                                總之,UP.SIGHT 2.0不僅提升了單細(xì)胞研究的準(zhǔn)確性和效率,還為未來(lái)的細(xì)胞生物學(xué)研究提供了強(qiáng)有力的工具支持。這一技術(shù)的出現(xiàn),將推動(dòng)細(xì)胞研究領(lǐng)域的發(fā)展,為深入理解細(xì)胞行為與特性奠定基礎(chǔ)。
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