UP.SIGHT 2.0 雙重驗證技術(shù)賦能單克隆細(xì)胞株開發(fā)，單克隆性超99.99%
單克隆細(xì)胞株的開發(fā)在生物制藥生產(chǎn)（如單克隆抗體制備）中占據(jù)關(guān)鍵地位。為了確保產(chǎn)品的一致性，所使用的細(xì)胞株必須來源于單個細(xì)胞。常見的克隆工作流程通常包括一至兩輪的單細(xì)胞克隆，隨后通過孔板成像確認(rèn)單細(xì)胞是否成功分配。然而，傳統(tǒng)的有限稀釋法或流式細(xì)胞術(shù)等方法并不能有效驗證是否僅分配了單個細(xì)胞，這使得單克隆性的確認(rèn)過于依賴孔板成像的準(zhǔn)確性�？装宄上裨诩�(xì)胞檢測時存在固有誤差，同時需要依賴離心操作以確保所有細(xì)胞位于成像焦平面內(nèi)。這些誤差的累積降低了在特定工作流程中實現(xiàn)單克隆性的可能性，因此，高精度的成像技術(shù)和檢測方法顯得尤為重要。
UP.SIGHT 2.0 （影像式單細(xì)胞打印與成像系統(tǒng)）通過雙重驗證機制有效解決了細(xì)胞分配中的挑戰(zhàn)。該系統(tǒng)的第一次驗證是通過一系列噴嘴圖像記錄單細(xì)胞的分離情況，第二次驗證則采用3D全孔成像技術(shù)直接捕獲液體體積的圖像。這種3D成像技術(shù)能夠完整捕捉液體體積，從而避免了克隆后所需的離心操作。此外，UP.SIGHT 2.0還支持菌落生長后的實時監(jiān)測，兼容96、384和1536孔板，適用于高通量工作流程，且單細(xì)胞分配效率超過98%。
圖1. UP.SIGHT 2.0
本研究分析了4000個單細(xì)胞和近1000個生長的菌落，結(jié)果表明：結(jié)合噴嘴圖像與3D全孔成像，細(xì)胞株的單克隆性概率超過99.99%，且無需依賴熒光染色或成像技術(shù)。
結(jié)果展示
1. 在一個設(shè)備中提供單細(xì)胞分配、孔內(nèi)驗證和菌落跟蹤功能
UP.SIGHT 2.0為克隆、克隆驗證和追蹤提供了一個完整的工作流程（圖2）。流程的第一步是將細(xì)胞懸浮液加載到設(shè)備中的一次性墨盒中。在單細(xì)胞分配過程中，噴嘴會生成微型自由飛行液滴，并持續(xù)進行成像（圖2.1）。圖像處理算法實時評估即將到來的液滴，判斷其是否包含0、1或多個細(xì)胞。如果液滴被判定為包含0、多個細(xì)胞，或盡管只含一個細(xì)胞但其特征（如大小、圓度或熒光強度）不符合預(yù)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)，該液滴將被丟棄。相反，若檢測到1個單細(xì)胞，且該細(xì)胞的大小、圓度和熒光強度等均符合標(biāo)準(zhǔn)，則該細(xì)胞將被分配至孔板中。針對每個成功分配的單細(xì)胞，系統(tǒng)會生成五張圖像，以確認(rèn)單細(xì)胞的分離與排出情況。分配完成后，使用孔板下方的第二臺相機進行 3D 全孔成像，捕獲孔中的一系列圖像（圖2.2），這一成像設(shè)備為目標(biāo)孔中分配的單細(xì)胞提供了二次確認(rèn)。
3D全孔成像捕獲的圖像數(shù)量取決于板的類型和孔中介質(zhì)的體積，這種成像方式消除了對孔板進行離心的需求。由于成像是細(xì)胞在介質(zhì)中沉降時進行的，而細(xì)胞通常位于液體體積的上半部分，因此與僅在孔底進行第0天成像相比，這種方式大大減少了由于板或邊緣效應(yīng)造成的畸變影響，從而提升了細(xì)胞檢測的準(zhǔn)確性。
在克隆后的階段，UP.SIGHT 2.0能夠?qū)哂欣硐肷L曲線的特定克隆進行成像并追蹤其群體生長（圖2.3）。圖3展示了一個經(jīng)過驗證為源自單個細(xì)胞的群體，該驗證是通過噴嘴影像及第0天的3D全孔成像完成。展示了細(xì)胞在底部沉淀后的狀態(tài)，以及在分配事件后的第1天、第4天和第7天所拍攝的后續(xù)影像。整個成像過程快速且高效，僅需約3分鐘即可處理一個384孔的板，從而實現(xiàn)后續(xù)的高通量群體追蹤。
圖2.UP.SIGHT 2.0對于每個孔的工作流程
1）通過噴嘴成像可以驗證分配的液滴中僅包含單個細(xì)胞，2）對分配后的孔進行一系列3D全孔成像，以做第二次驗證，3）對隨時間生長的菌落進行成像以確保克隆性的一致性。
圖3.UP.SIGHT在菌落生長追蹤中的應(yīng)用，分別為第0、1、4和7天的菌落成像。
2. 噴嘴圖像與3D全孔成像相結(jié)合，為單克隆性細(xì)胞分配提供了多重保證
噴嘴圖像與3D全孔成像的結(jié)合進一步驗證了細(xì)胞在孔板中的分布情況。與有限稀釋法或流式細(xì)胞術(shù)等傳統(tǒng)方法相比，UP.SIGHT 2.0在單細(xì)胞分配過程中提供了更可靠的驗證，單細(xì)胞分配效率超過98%。然而，算法在某些情況下可能會誤判為僅分配了一個細(xì)胞，而實際上可能是兩個相互粘連的細(xì)胞。因此，引入3D全孔成像為單細(xì)胞分配的確認(rèn)提供了第二種方法，以確保僅有一個細(xì)胞被分配。
圖4展示了兩個噴嘴圖像及其相應(yīng)的3D全孔成像示例。在這些示例中，紅色和綠色CHO細(xì)胞被混合并分配，所形成的菌落也被熒光成像儀捕捉到。在圖4.1中，噴嘴圖像清晰顯示僅選擇了一個細(xì)胞，3D全孔成像顯示的單個細(xì)胞和單色菌落進一步驗證了這一點，證實這是一個單克隆細(xì)胞系。而在圖4.2中，僅憑噴嘴圖像難以確認(rèn)是否僅選擇了一個細(xì)胞，而3D全孔成像則清楚地證實分配了兩個細(xì)胞，并且這兩個細(xì)胞分別生成了紅色和綠色的菌落。在這個例子中，噴嘴圖像與3D全孔成像的結(jié)合幫助判定這是一個非克隆的細(xì)胞群體，并將其排除在進一步分析之外。
圖4.UP.SIGHT通過噴嘴和3D全孔成像為克隆性提供多種保證
3. 實現(xiàn)>99.99%的單克隆概率
為確定UP.SIGHT 2.0實現(xiàn)單克隆性的概率，我們計算了噴嘴圖像和3D全孔成像相關(guān)的誤差率。本研究采用紅色和綠色1:1混合的CHO細(xì)胞，評估單細(xì)胞分配和3D全孔成像的錯誤率。
根據(jù)噴嘴圖像將4000多個細(xì)胞分配到孔板中，以確定噴嘴圖像的誤差率。驗證孔板中的細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，41個孔實際上包含兩個細(xì)胞，因此可以確認(rèn)噴嘴圖像的誤差率為1.0%。
對于3D全孔成像的誤差率，我們保留了一部分孔板用于菌落評估，并將3D全孔圖像中標(biāo)記為單個細(xì)胞的孔與實際獲得的菌落進行比較。紅色和綠色細(xì)胞均被沉積，因此任何含有多色菌落的孔都表明存在3D全孔成像誤差。經(jīng)過評估，1800多個孔中得出了991個菌落，其中有2個混合顏色的菌落被錯誤分類。由此，3D全孔成像的誤差率估計為0.7%。將這兩個誤差率相乘，得出UP.SIGHT 2.0提供的單克隆性概率超過99.99%。盡管在3D全孔圖像中無法將兩個混合顏色的菌落識別為非克隆菌落，但在相應(yīng)的噴嘴圖像中，這兩個孔均能被識別為非克隆。
4. 部分3D全孔成像不僅提供了>99.99%的單克隆性概率，還顯著提升了成像速度
在3D全孔成像過程中，細(xì)胞聚焦的圖像堆疊位置在各孔板之間保持一致。此過程中共獲取了81張圖像，以全面覆蓋孔體積。對1500多個孔的評估顯示，細(xì)胞的平均位置位于圖像堆疊的第65層（圖像1為孔底，圖像81為液體頂部），其標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.2，最小值為第45張圖像。這些變化主要源于孔底高度的不一致及移液過程中的誤差。由于細(xì)胞沉降速度較慢，細(xì)胞在分配后不太可能立即位于孔板的下部。因此，可以省略對孔底的成像，從中間層開始拍攝至液體頂部，從而有效減少處理時間，同時保持較高的單克隆性概率。表2展示了384孔板示例中每個孔的細(xì)胞聚焦圖像堆疊位置。盡管捕獲了81張圖像，但從液體體積中心開始的40幅圖像已足以捕捉所有細(xì)胞，并實現(xiàn)與3D全孔成像相同的單克隆性概率。表3對不同工作流程進行了比較，展示了各自的處理時間和單克隆性概率。 
表2.在3D全孔成像中，從液體體積中心成像仍然可以捕獲細(xì)胞，并保持高概率的單克隆性。81張圖像覆蓋整個體積，細(xì)胞通常在圖像55至70間可見。由于細(xì)胞沉降緩慢，僅需從中心開始的40張圖像，無需評估孔的下半部分。
表3.工作流程處理時間的比較
實驗結(jié)論
UP.SIGHT 2.0是一種多功能設(shè)備，具備單細(xì)胞的分離、驗證與菌落生長監(jiān)測能力。其創(chuàng)新的3D全孔成像技術(shù)為每個孔提供全面的液體體積成像，完全不依賴離心孔板進行單細(xì)胞分配驗證，這一創(chuàng)新顯著提升了實驗的靈活性和準(zhǔn)確性。
通過對單細(xì)胞的成像與記錄，UP.SIGHT 2.0為克隆性驗證提供了可靠的雙重保障。以上研究對超過4000個單細(xì)胞進行了深入驗證，結(jié)果顯示該工作流程實現(xiàn)了超過99.99%的單克隆率。此外，部分3D全孔成像結(jié)果顯示，單克隆性的概率也超過99.99%，并且成像速度顯著提高，這進一步增強了實驗效率和可靠性。
總之，UP.SIGHT 2.0不僅提升了單細(xì)胞研究的準(zhǔn)確性和效率，還為未來的細(xì)胞生物學(xué)研究提供了強有力的工具支持。這一技術(shù)的出現(xiàn)，將推動細(xì)胞研究領(lǐng)域的發(fā)展，為深入理解細(xì)胞行為與特性奠定基礎(chǔ)。
UP.SIGHT 2.0 （影像式單細(xì)胞打印與成像系統(tǒng)）通過雙重驗證機制有效解決了細(xì)胞分配中的挑戰(zhàn)。該系統(tǒng)的第一次驗證是通過一系列噴嘴圖像記錄單細(xì)胞的分離情況，第二次驗證則采用3D全孔成像技術(shù)直接捕獲液體體積的圖像。這種3D成像技術(shù)能夠完整捕捉液體體積，從而避免了克隆后所需的離心操作。此外，UP.SIGHT 2.0還支持菌落生長后的實時監(jiān)測，兼容96、384和1536孔板，適用于高通量工作流程，且單細(xì)胞分配效率超過98%。
圖1. UP.SIGHT 2.0
本研究分析了4000個單細(xì)胞和近1000個生長的菌落，結(jié)果表明：結(jié)合噴嘴圖像與3D全孔成像，細(xì)胞株的單克隆性概率超過99.99%，且無需依賴熒光染色或成像技術(shù)。
結(jié)果展示
1. 在一個設(shè)備中提供單細(xì)胞分配、孔內(nèi)驗證和菌落跟蹤功能
UP.SIGHT 2.0為克隆、克隆驗證和追蹤提供了一個完整的工作流程（圖2）。流程的第一步是將細(xì)胞懸浮液加載到設(shè)備中的一次性墨盒中。在單細(xì)胞分配過程中，噴嘴會生成微型自由飛行液滴，并持續(xù)進行成像（圖2.1）。圖像處理算法實時評估即將到來的液滴，判斷其是否包含0、1或多個細(xì)胞。如果液滴被判定為包含0、多個細(xì)胞，或盡管只含一個細(xì)胞但其特征（如大小、圓度或熒光強度）不符合預(yù)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)，該液滴將被丟棄。相反，若檢測到1個單細(xì)胞，且該細(xì)胞的大小、圓度和熒光強度等均符合標(biāo)準(zhǔn)，則該細(xì)胞將被分配至孔板中。針對每個成功分配的單細(xì)胞，系統(tǒng)會生成五張圖像，以確認(rèn)單細(xì)胞的分離與排出情況。分配完成后，使用孔板下方的第二臺相機進行 3D 全孔成像，捕獲孔中的一系列圖像（圖2.2），這一成像設(shè)備為目標(biāo)孔中分配的單細(xì)胞提供了二次確認(rèn)。
3D全孔成像捕獲的圖像數(shù)量取決于板的類型和孔中介質(zhì)的體積，這種成像方式消除了對孔板進行離心的需求。由于成像是細(xì)胞在介質(zhì)中沉降時進行的，而細(xì)胞通常位于液體體積的上半部分，因此與僅在孔底進行第0天成像相比，這種方式大大減少了由于板或邊緣效應(yīng)造成的畸變影響，從而提升了細(xì)胞檢測的準(zhǔn)確性。
在克隆后的階段，UP.SIGHT 2.0能夠?qū)哂欣硐肷L曲線的特定克隆進行成像并追蹤其群體生長（圖2.3）。圖3展示了一個經(jīng)過驗證為源自單個細(xì)胞的群體，該驗證是通過噴嘴影像及第0天的3D全孔成像完成。展示了細(xì)胞在底部沉淀后的狀態(tài)，以及在分配事件后的第1天、第4天和第7天所拍攝的后續(xù)影像。整個成像過程快速且高效，僅需約3分鐘即可處理一個384孔的板，從而實現(xiàn)后續(xù)的高通量群體追蹤。
圖2.UP.SIGHT 2.0對于每個孔的工作流程
圖3.UP.SIGHT在菌落生長追蹤中的應(yīng)用，分別為第0、1、4和7天的菌落成像。
2. 噴嘴圖像與3D全孔成像相結(jié)合，為單克隆性細(xì)胞分配提供了多重保證
噴嘴圖像與3D全孔成像的結(jié)合進一步驗證了細(xì)胞在孔板中的分布情況。與有限稀釋法或流式細(xì)胞術(shù)等傳統(tǒng)方法相比，UP.SIGHT 2.0在單細(xì)胞分配過程中提供了更可靠的驗證，單細(xì)胞分配效率超過98%。然而，算法在某些情況下可能會誤判為僅分配了一個細(xì)胞，而實際上可能是兩個相互粘連的細(xì)胞。因此，引入3D全孔成像為單細(xì)胞分配的確認(rèn)提供了第二種方法，以確保僅有一個細(xì)胞被分配。
圖4展示了兩個噴嘴圖像及其相應(yīng)的3D全孔成像示例。在這些示例中，紅色和綠色CHO細(xì)胞被混合并分配，所形成的菌落也被熒光成像儀捕捉到。在圖4.1中，噴嘴圖像清晰顯示僅選擇了一個細(xì)胞，3D全孔成像顯示的單個細(xì)胞和單色菌落進一步驗證了這一點，證實這是一個單克隆細(xì)胞系。而在圖4.2中，僅憑噴嘴圖像難以確認(rèn)是否僅選擇了一個細(xì)胞，而3D全孔成像則清楚地證實分配了兩個細(xì)胞，并且這兩個細(xì)胞分別生成了紅色和綠色的菌落。在這個例子中，噴嘴圖像與3D全孔成像的結(jié)合幫助判定這是一個非克隆的細(xì)胞群體，并將其排除在進一步分析之外。
圖4.UP.SIGHT通過噴嘴和3D全孔成像為克隆性提供多種保證
3. 實現(xiàn)>99.99%的單克隆概率
為確定UP.SIGHT 2.0實現(xiàn)單克隆性的概率，我們計算了噴嘴圖像和3D全孔成像相關(guān)的誤差率。本研究采用紅色和綠色1:1混合的CHO細(xì)胞，評估單細(xì)胞分配和3D全孔成像的錯誤率。
根據(jù)噴嘴圖像將4000多個細(xì)胞分配到孔板中，以確定噴嘴圖像的誤差率。驗證孔板中的細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，41個孔實際上包含兩個細(xì)胞，因此可以確認(rèn)噴嘴圖像的誤差率為1.0%。
對于3D全孔成像的誤差率，我們保留了一部分孔板用于菌落評估，并將3D全孔圖像中標(biāo)記為單個細(xì)胞的孔與實際獲得的菌落進行比較。紅色和綠色細(xì)胞均被沉積，因此任何含有多色菌落的孔都表明存在3D全孔成像誤差。經(jīng)過評估，1800多個孔中得出了991個菌落，其中有2個混合顏色的菌落被錯誤分類。由此，3D全孔成像的誤差率估計為0.7%。將這兩個誤差率相乘，得出UP.SIGHT 2.0提供的單克隆性概率超過99.99%。盡管在3D全孔圖像中無法將兩個混合顏色的菌落識別為非克隆菌落，但在相應(yīng)的噴嘴圖像中，這兩個孔均能被識別為非克隆。
4. 部分3D全孔成像不僅提供了>99.99%的單克隆性概率，還顯著提升了成像速度
在3D全孔成像過程中，細(xì)胞聚焦的圖像堆疊位置在各孔板之間保持一致。此過程中共獲取了81張圖像，以全面覆蓋孔體積。對1500多個孔的評估顯示，細(xì)胞的平均位置位于圖像堆疊的第65層（圖像1為孔底，圖像81為液體頂部），其標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.2，最小值為第45張圖像。這些變化主要源于孔底高度的不一致及移液過程中的誤差。由于細(xì)胞沉降速度較慢，細(xì)胞在分配后不太可能立即位于孔板的下部。因此，可以省略對孔底的成像，從中間層開始拍攝至液體頂部，從而有效減少處理時間，同時保持較高的單克隆性概率。表2展示了384孔板示例中每個孔的細(xì)胞聚焦圖像堆疊位置。盡管捕獲了81張圖像，但從液體體積中心開始的40幅圖像已足以捕捉所有細(xì)胞，并實現(xiàn)與3D全孔成像相同的單克隆性概率。表3對不同工作流程進行了比較，展示了各自的處理時間和單克隆性概率。
表2.在3D全孔成像中，從液體體積中心成像仍然可以捕獲細(xì)胞，并保持高概率的單克隆性。81張圖像覆蓋整個體積，細(xì)胞通常在圖像55至70間可見。由于細(xì)胞沉降緩慢，僅需從中心開始的40張圖像，無需評估孔的下半部分。
表3.工作流程處理時間的比較
實驗結(jié)論
UP.SIGHT 2.0是一種多功能設(shè)備，具備單細(xì)胞的分離、驗證與菌落生長監(jiān)測能力。其創(chuàng)新的3D全孔成像技術(shù)為每個孔提供全面的液體體積成像，完全不依賴離心孔板進行單細(xì)胞分配驗證，這一創(chuàng)新顯著提升了實驗的靈活性和準(zhǔn)確性。
通過對單細(xì)胞的成像與記錄，UP.SIGHT 2.0為克隆性驗證提供了可靠的雙重保障。以上研究對超過4000個單細(xì)胞進行了深入驗證，結(jié)果顯示該工作流程實現(xiàn)了超過99.99%的單克隆率。此外，部分3D全孔成像結(jié)果顯示，單克隆性的概率也超過99.99%，并且成像速度顯著提高，這進一步增強了實驗效率和可靠性。
總之，UP.SIGHT 2.0不僅提升了單細(xì)胞研究的準(zhǔn)確性和效率，還為未來的細(xì)胞生物學(xué)研究提供了強有力的工具支持。這一技術(shù)的出現(xiàn)，將推動細(xì)胞研究領(lǐng)域的發(fā)展，為深入理解細(xì)胞行為與特性奠定基礎(chǔ)。
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