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豬作為主要的肉類來源和人類疾病的理想模型，其肌肉發(fā)育研究對于農業(yè)和生物醫(yī)學都至關重要。商業(yè)品種（commercial breeds，瘦肉型）和本土品種（indigenous breeds，肥胖型）之間在肌肉生長上存在顯著的表型差異，為鑒定肌肉發(fā)育中的關鍵基因和通路提供了絕佳模型。盡管已經(jīng)在轉錄水平上對豬肌肉進行了廣泛的測序研究，但針對轉錄后調控，尤其是表觀遺傳修飾的高通量測序研究仍然較少。m6A作為真核生物mRNA中最豐富的轉錄后修飾，幾乎調控mRNA代謝的所有方面，包括轉錄、pre-mRNA處理、翻譯和降解。m6A修飾由一組“writers”酶復合體催化，包括甲基轉移酶樣3（METTL3）、METTL14、Wilms腫瘤相關蛋白（WTAP）和ZC3H13。m6A修飾可以由“erasers”酶如FTO和ALKBH5動態(tài)可逆。m6A修飾通過多種機制促進mRNA翻譯。在mRNA穩(wěn)定性調控方面，m6A主要通過YTHDF2促進mRNA降解。近期研究發(fā)現(xiàn)m6A的替代作用，即IGF2BP蛋白介導其增強mRNA穩(wěn)定性和保守功能。

近日，湖北省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所助理研究員顧浩博士為第一作者、湖北省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所/湖北省洪山實驗室畢延震研究員和中國科學院亞熱帶農業(yè)研究所印遇龍院士為共同通訊在《cells》雜志發(fā)表了題為“N6-Methyladenosine RNA Modification Regulates the Differential Muscle Development in Large White and Ningxiang Pigs”的研究論文，研究了N6-甲基腺苷（m6A）RNA修飾在大約克豬（Large White, LW）和寧鄉(xiāng)豬（Ningxiang, NX）肌肉發(fā)育差異中的調控作用。研究通過MeRIP-seq技術揭示了m6A甲基化模式，并發(fā)現(xiàn)m6A修飾在肌肉細胞發(fā)育、肌原纖維、細胞周期和磷酸酶調節(jié)活性等方面對肌肉發(fā)育的新生兒階段具有調控作用。特別地，研究指出m6A修飾通過YTHDF2依賴性方式加速了特定肌肉特異性跨膜蛋白WFS1降解，并鑒定出一個單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點C21551T，該位點在WFS1基因的最后一個外顯子中，導致LW和NX豬中WFS1表達水平的差異。
 

本研究鑒定了大約克豬（Large White, LW）和寧鄉(xiāng)豬（Ningxiang, NX）不同品種新生仔豬肌肉發(fā)育過程中的差異表達基因，并通過MeRIP-seq繪制了m6A甲基化模式。研究結果表明，m6A修飾在肌肉發(fā)育的新生仔豬階段調控肌肉細胞發(fā)育、肌原纖維、細胞周期和磷酸酶調節(jié)活性。且LW和NX豬中差異表達基因主要富集在參與蛋白質合成通路中。對MeRIP-seq和RNA-seq數(shù)據(jù)進行聯(lián)合分析，共鑒定出27個差異表達且m6A修飾基因。還鑒定出一種典型的肌肉特異性包膜跨膜蛋白WFS1，在LW和NX豬中通過m6A修飾被差異調控，進一步揭示了m6A修飾以YTHDF2依賴方式加速了WFS1降解。最后鑒定了WFS1最后一個外顯子中的C21551T導致m6A甲基化變化，從而影響LW和NX豬中的WFS1表達水平差異。本研究對NX和LW豬在新生仔豬肌肉發(fā)育期間的m6A修飾進行了全面分析，并闡明了m6A修飾對這兩個品種WFS1差異表達的調控機制。

圖1：5日齡NX豬和LW豬背最長肌特征。

圖2：m6A修飾參與調控肌肉發(fā)育。

1. qPCR實驗檢測NX和LW豬肌肉中與m6A相關基因的表達水平。
2. 代表性NX和LW豬背最長肌切片中FTO（綠色）圖像；DAPI用于核染色（藍色）。
3. Western blotting實驗結果表明，在LW豬肌肉中FTO表達水平升高，METTL4表達水平降低。
4. 使用ImageJ軟件對m6A水平進行定量分析。
5. Western blotting實驗結果表明，在分化后第0、2和4天，豬衛(wèi)星細胞（PSCs）中FTO蛋白表達顯著增加。
6. Myhc免疫熒光染色顯示，F(xiàn)TO過表達顯著增加了Myhc+細胞比例，而FTO敲低顯著減少了Myhc+細胞的比例（n = 3）。* p < 0.05，** p < 0.01。

圖3：mRNA m6A甲基化在LW和NX豬肌肉中的整體特征。

1. 檢測NX和LW豬肌肉中m6A修飾工作流程。通過免疫沉淀(IP)純化含m6A的mRNA片段。
2. 每組m6A peaks的平均數(shù)量。
3. 沿轉錄本的m6A peaks密度。
4. LW和NX豬肌肉中m6A富集的共有motifs。
5. NX-1豬染色體上m6A富集區(qū)域分布。

F-G. (F) GO和(G) KEGG富集分析，在NX-1豬肌肉樣本中有2035個基因發(fā)生m6A修飾。

圖4：LW和NX豬肌肉之間差異性m6A修飾的比較。

1. LW和NX豬肌肉之間差異性m6A修飾基因火山圖
2. 染色體上富集區(qū)域中差異性m6A修飾基因分布。

C-D. mRNA區(qū)域中顯著差異m6A peaks分布。

E. KEGG富集分析顯示LW與NX豬肌肉中差異性上調的m6A修飾基因。

F. KEGG富集分析顯示LW與NX豬肌肉中差異性下調的m6A修飾基因。

圖5：LW和NX豬骨骼肌的mRNA中差異表達水平。

1. 差異表達的mRNA基因火山圖。
2. 差異表達的mRNA基因分層聚類分析。
3. qPCR結果顯示LW豬中上調的mRNA表達。
4. qPCR結果顯示LW豬中下調的mRNA表達。
5. 通過GO分析富集的前30個差異表達基因通路。
6. 通過KEGG預測富集的前30個差異表達基因通路。* p < 0.05，** p < 0.01。

圖6：RNA-Seq和MeRIP-Seq的綜合分析。

1. 差異性m6A甲基化和mRNA表達變化的peaks數(shù)量韋恩圖。
2. 四象限圖展示基因分布情況。不同顏色表示RNA表達或m6A甲基化水平不同變化。
3. 熱圖顯示了27個甲基化水平有顯著差異基因的表達情況。
4. IgG作為陰性對照，通過MeRIP-qPCR驗證5個m6A甲基化基因。
5. qPCR分析顯示，與NX豬相比，LW豬中5個高表達上調基因的表達增加。
6. 在SH3BP4基因位點上，IGV可視化顯示RNA-seq（灰色）數(shù)據(jù)和MeRIP-seq（紅色和藍色）數(shù)據(jù)。

圖7：m6A修飾調控NX和LW豬肌肉中WFS1的差異表達。

1. 基因組瀏覽器軌跡顯示W(wǎng)FS1基因位點的RNA-seq（灰色）和MeRIP-seq（藍色和綠色）數(shù)據(jù)。
2. MeRIP-qPCR驗證WFS1的m6A修飾。IgG作為陰性對照。
3. 檢測LW和NX豬肌肉中WFS1的表達。
4. 用FB23-2或DMSO處理的PSCs中WFS1 mRNA表達的RT-PCR分析。
5. 檢測用FB23-2或DMSO處理的PSCs中WFS1 mRNA降解率。
6. 在干擾YTHDF2后，檢測DMSO和FB23-2處理組中WFS1的表達。
7. 兩個品種仔豬共6個樣本在m6A結合peaks序列和SNP位點的測序結果。
8. m6A結合peaks的SNP位點的雙熒光檢測。包含C或T的結合片段被克隆到pmirGLO質粒中，分別命名為pmirGLO-MutC和pmirGLO-MutT（上圖）。然后，它們與陰性對照空載體（pmirGLO-WT）一起轉染入PSCs，隨后用FB23-2處理（紅色+/−）。